p38MAPK介導高糖下調腎小管上皮細胞表達BMP－7*

肖 瑛， 方開云， 石明雋， 劉瑞霞， 桂華珍， 郭 兵， 張國忠

(貴陽醫學院病理生理學教研室，貴州 貴陽 550004)

有研究表明［1，2］，高糖狀態和糖尿病腎病時腎小管上皮細胞表達骨形態發生蛋白－7(bone morphogenetic protein－7，BMP－7)減少，給予外源性 BMP－7或轉基因過表達BMP－7可改善腎小管間質纖維化，逆轉腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化，減少腎小管上皮細胞的丟失，促進腎小管上皮細胞功能的恢復。但高糖通過何種途徑下調腎小管上皮細胞表達BMP－7尚未見明確的報道。本課題組動物實驗研究提示［3］，高糖環境可激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)并且p38MAPK可能介導了糖尿病時BMP－7表達的下調，促進肌成纖維細胞活化，引起細胞外基質的大量沉積。為進一步證實p38MAPK是否確實參與高糖下調BMP－7的機制，我們進行了以下研究。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 雄性SD大鼠，重30－40 g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma)，山羊抗大鼠BMP－7多克隆抗體、羊抗大鼠p38MAPK、pp38MAPK多克隆抗體、驢抗山羊 －HRP(Santa Cruz)，兔抗大鼠纖維連接蛋白(fibronectin，FN)多克隆抗體、抗CK18抗體、抗α－SMA抗體(武漢博士德公司)，UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒(羊)(福州邁新生物技術開發有限公司，KIT－9709/9719)，培養細胞 RNA提取試劑盒、Taq PCR MasterMix、DNA MarkerⅠ(北京TIANGEN生物技術有限公司)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas);p38MAPK特異性阻斷劑SB202190(Calbiochem);低糖DMEM(HyClone);胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco Introvagen)，D －glucose、D －mannitol(BBI)。

2 方法

2.1 大鼠原代腎小管上皮細胞的培養和鑒定 SD大鼠乙醚麻醉后無菌操作取出腎臟，去掉包膜和髓質，留下皮質剪碎后于80目篩網研磨，100目收集沉淀入離心管內，0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，1500 r/min離心10 min，含10%胎牛血清的DMEM終止消化，經臺盼藍計數后以2×105細胞接種于培養瓶，置37℃、5%CO2培養箱中培養。貼壁生長的腎小管上皮細胞采用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA·Na2消化傳代，取3代細胞經鑒定為腎小管上皮細胞后進行下列分組實驗，重復4次。

鑒定依據參照方開云等［4］報道:(1)細胞生長周期和形態;(2)免疫細胞化學方法檢測角蛋白18(CK18)陽性和α－SMA陰性為腎小管上皮細胞。

2.2 原代腎小管上皮細胞實驗分組 待細胞生長融合至約80%時，換無血清含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基培養24 h，使細胞生長同步于靜止期。將細胞分為(1)正常對照組，用DMEM+10%FCS培養;(2)高糖組，用20 mmol/L D－glucose+DMEM+10%FCS培養;(3)SB202190處理組，用 SB20219020 μmol/L預處理細胞40 min，然后加入20 mmol/L D－glucose+DMEM+10%FCS培養;(4)高滲組，用20 mmol/L D－mannitol+DMEM+10%FCS培養，72 h后收集細胞。

2.3 免疫細胞化學檢測BMP－7和FN的表達 于6孔板培養各組細胞72 h后，爬片經PBS洗滌3次后用4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX－100打孔，采用SP法，分別加入BMP－7和FNⅠ抗(工作濃度均為1∶50)，4℃孵育過夜，PBS緩沖液替代Ⅰ抗作為陰性對照。第2 dⅡ抗孵育，DAB顯色。

2.4 Western blotting檢測p38MAPK和p－p38MAPK蛋白水平 取培養瓶中每106個細胞加裂解液200 μL，4℃裂解30 min，離心取上清測定蛋白含量，經SDS－PAGE垂直凝膠電泳后，300 mA電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBS洗膜后分別加抗 p38MAPK(1∶200)和 p－p38MAPK(1∶200)抗體4℃孵育過夜;加Ⅱ抗室溫孵育2h，ECL試劑曝光。用抗體剝脫液剝脫抗體后，按同樣的方法與抗β－actin抗體(1∶300)孵育。凝膠成像系統進行圖像分析。以β－actin蛋白條帶作內參照，結果用靶蛋白/β－actin比值表示。

2.5 RT－PCR檢測BMP－7和FN mRNA水平 用Trizol試劑提取腎小管上皮細胞總RNA，核酸蛋白分析儀檢測含量。0.5 μg總RNA以Oligo(dT)18primer為反轉錄引物，合成cDNA。以cDNA為模板按逆轉錄試劑盒方法進行RT－PCR。引物自行設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。BMP－7引物序列為:上游 5'－GCACCTCCAGGGAAAAC －3'，下游 5'－AAGCCCAGATGGTACGG－3'，擴增產物長度為451 bp;β－actin引物序列為:上游5'－TGGCATTGTGATGGACTC －3'，下游5'－CCGATAGTGATGACCTGAC－3'，擴增產物長度為306 bp;PCR反應條件:94℃預變性5 min，94℃ 45 s，56.3℃ 30 s，72℃45 s，40個循環后充分延伸10 min。FN引物序列為:上游5'－GGACACTATGCGGGTCACTT－3'，下游 5'－TCAAAACCAGTTGGGGAGTC －3'，擴增產物長度為 291bp;β－actin引物序列為:上游 5'－GAAATCGTGCGTGACATTAAG －3'，下游 5'－CTAGAAGCATTTGCGGTGGA－3'，擴增產物長度為490 bp;PCR反應條件:94℃預變性2 min，94℃30 s，54.2℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環后充分延伸10 min。最后將擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像系統進行掃描并用ChmioDox軟件分析圖像，PCR產物量以吸光度值×面積表示，與β－actin比值表示BMP－7和FN的相對含量。

3 統計學處理

結 果

1 腎小管上皮細胞的生長狀況及鑒定

細胞的生長從培養48 h開始，腎小管節段周圍可見卵圓形上皮樣細胞長出，圍繞腎小管呈島嶼狀向四周逐漸增大，見圖1。第5－6 d基本鋪滿培養瓶底部，細胞形態為多邊鵝卵石樣，體積較大、鏡下透明度及折光性強，各細胞互相緊密相靠，可見融合成片及復層生長。經胰酶消化傳代后，腎小管上皮細胞以單個細胞貼壁并呈對數生長，符合上皮細胞生長特性。

細胞爬片行免疫細胞化學染色顯示，CK18均呈棕黃色、α－SMA未見陽性染色表示其為腎小管上皮細胞，見圖2。

2 免疫細胞化學顯示BMP－7和FN蛋白的表達

免疫細胞化學顯示，BMP－7主要表達于對照組腎小管上皮細胞胞漿，高糖組BMP－7的表達顯著減少，SB202190處理組表達則較高糖組明顯增多，與高滲組比較無顯著差異。對照組有少量FN蛋白表達，高糖組較對照組顯著升高，SB202190處理組與高糖組比較顯著減少，高滲組與對照組相比無顯著差異，見圖3。

Figure 1.Morphology of primary renal tubular epithelial cells(3 rd day of incubation，×200).圖1 原代培養腎小管上皮細胞活體觀察

Figure 2.The expression of CK18 and α － SMA proteins in primary renal tubular epithelial cells(SABC，×400).A:CK18;B:α －SMA.圖2 免疫細胞化學顯示CK18和α－SMA在腎小管上皮細胞的表達

Figure 3.Immunocytochemistry shows the expression of BMP－7 and FN protein in primary renal tubular epithelial cells from control(A)，high glucose(B)，SB202190－treated(C)and D－mannitol(D)groups(SABC，×400).圖3 免疫細胞化學顯示BMP－7和FN在腎小管上皮細胞中的表達

3 Western blotting顯示p38MAPK和p－p38MAPK蛋白表達

Western blotting結果顯示在培養的腎小管上皮細胞，對照組有少量 p38MAPK表達，p－p38MAPK基本沒有表達。高糖刺激72 h后，總p38MAPK和p－p38MAPK蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，SB202190處理組總p38MAPK的變化不大，而pp38MAPK的表達卻顯著降低，較高糖組減少約80%(P＜0.05)，表明 SB202190能有效抑制 p38MAPK磷酸化，見圖4。

Figure 4.The levels of p38MAPK(A)and p－p38MAPK(B)proteins in primary renal tubular epithelial cells by Western blotting.1:control;2:mannitol;3:high glucose;4:SB202190+high glucose..n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs high glucose group.圖4 Western blotting檢測p38MAPK(A)和p－p38MAPK(B)蛋白在腎小管上皮細胞中的表達

4 RT－PCR顯示BMP－7和FN的mRNA水平

在正常糖濃度培養的腎小管上皮細胞中BMP－7 mRNA水平較高，與在高滲環境中無差異，高糖組其轉錄水平下降約100%，而SB202190處理組BMP－7 mRNA水平顯著提高，甚至超過正常對照組。而FN在正常糖濃度與高滲環境中轉錄水平很低，高糖組轉錄水平明顯提高，而SB202190處理組FN mRNA明顯減少，見圖5。

Figure 5.The levels of BMP －7 and FN mRNAs in primary renal tubular epithelial cells.1:control;2:mannitol;3:high glucose;4:SB202190+high glucose..n=4.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs high glucose group.圖5 BMP－7和FN mRNA在腎小管上皮細胞中的表達

討 論

有研究發現在腎臟發育過程中，BMP－7能促使輸尿管芽形成和腎臟上皮細胞從間充質細胞分化從而形成正常腎組織。而腎臟疾病時，BMP－7可以上調上皮細胞表型的標志物E－鈣黏素的表達，從而抑制EMT以維持正常腎臟細胞表型;減少上皮細胞凋亡，促進細胞增殖，從而減輕纖維化;抑制促炎癥因子的釋放，減少炎癥細胞的浸潤，減輕間質纖維化;能夠拮抗TGF－β1的致腎纖維化作用而發揮其抑制腎纖維化的作用;促進ECM的降解;因此BMP－7已被證實在調節和控制腎小管間質纖維化和腎小球硬化中扮演重要角色［5］。DN時腎組織 BMP－7表達減少，外源性給予或促進內源性BMP－7恢復可保護甚至逆轉DN腎功能和病理改變，且BMP－7作為一種內源性分子，作為藥物治療DN其毒性幾乎為零［6］。我們前期的研究發現［3，7］，STZ 誘導的 DM大鼠模型隨病程延長腎皮質BMP－7的表達較正常對照組顯著減少，與腎小管間質損害程度呈顯著負相關，使用胰島素或中藥丹芪合劑在促進內源性BMP－7表達恢復的同時ECM沉積和腎小管間質損害程度被顯著減輕。由于目前研究BMP－7多在細胞株培養，而在原代腎小管上皮細胞加入高糖培養的研究較少，故本實驗觀察了從大鼠腎皮質提取腎小管節段進行原代腎小管上皮細胞培養，傳至3代后靜止24 h加入20 mmol/L D－glucose孵育，發現隨著培養時間的延長，BMP－7的表達也是逐漸減少的，至72 h后其mRNA表達幾乎缺失，與體內實驗變化是一致的。

p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶信號分子家族，該信號分子可被磷酸化為p－p38MAPK而激活，完成由胞漿移位至胞核的核轉位過程，進而調節相關基因轉錄［8，9］。我們體內實驗觀察到從DM 2周開始p－p38MAPK胞核陽性染色，8周組達高峰，此后一直維持在高水平。BMP－7mRNA的減少與pp38MAPK增多平行，并且 BMP－7蛋白與 pp38MAPK表達呈負相關，提示了DM腎小管上皮細胞p38MAPK與BMP－7之間可能存在相互調節關系［3］。這與 Motazed等［10］在人近曲小管上皮細胞中發現相一致。但是這并不能確切表明p38MAPK可作為BMP－7的上游信號分子來調節其表達。為了進一步觀察p38MAPK是否參與高糖下調BMP－7的表達，我們在原代培養的腎小管上皮細胞中加入高糖共同孵育的研究來進行觀察。研究發現在正常糖培養環境下，腎小管上皮細胞BMP－7蛋白表達和轉錄水平均較高，有少量總p38MAPK表達，但未見活化的p38MAPK;高糖刺激72 h后，總p38MAPK和p－p38MAPK蛋白表達明顯增加，p－p38MAPK增加尤為明顯，而BMP－7蛋白和mRNA的表達卻顯著減少，FN蛋白和mRNA的表達也顯著增多;在高糖環境中應用p38MAPK特異性阻斷劑SB202190處理 72 h后，總 p38MAPK的變化不大，而 pp38MAPK的表達卻顯著降低，較高糖組減少約80%，同時BMP－7蛋白和mRNA的表達卻由此明顯增多，說明該抑制劑減少了活化的p38MAPK，這可能解除了對BMP－7的抑制作用而使內源性BMP－7的表達恢復且伴隨FN的沉積減少，提示p38MAPK信號通路參與介導高糖刺激下腎小管上皮細胞BMP－7表達下調，阻斷此信號通路可引起內源性BMP－7表達上調，從而使細胞外基質FN減少。這與在軟骨細胞的研究［11］一致。

通過體內體外實驗，雖然發現p38MAPK信號通路可能參與介導HG刺激腎小管上皮細胞BMP－7表達的下調，得到p38MAPK可作為BMP－7的上游信號，參與調節BMP－7的作用。但是p－p38MAPK是如何調節BMP－7的還不清楚，其作用環節有待進一步研究。

［1］Hu MC，Wasserman D，Hartwig S，et al.p38MAPK acts in the BMP7－dependent stimulatory pathway during epithelial cell morphogenesis and is regulated by Smad1［J］J Biol Chem，2004，279(13):12051 －12059.

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［4］方開云，石明雋，肖 瑛，等.Snail1 siRNA對高糖誘導腎小管上皮細胞表型轉變的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25(12):2424 －2429.

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［8］方開云，石明雋，肖 瑛，等.p38MAPK介導高糖誘導的腎小管上皮細胞向間充質細胞轉變［J］.生理學報，2008，60(6):759 －766.

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［10］Motazed R，Colville － Nash P，Kwan JT，et a1.BMP － 7 and proximal tubule epithelial cell:activation of multiple signaling pathways reveals a novel antifibrotic mechanism［J］.Pharm Ras，2008，25(10):2440 －2446.

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