糖尿病大鼠腎組織Smurf 2表達及其與SnoN蛋白降解的關系*

劉瑞霞， 郭 兵， 肖 瑛， 石明雋， 王圓圓， 桂華珍， 張國忠

(貴陽醫學院病理生理學教研室，貴州 貴陽 550004)

近年來，轉化生長因子－β1(transforming growth factor－β1，TGF－β1)/Smad信號在組織纖維化調控機制中的重要作用逐漸被認識［1］。在腫瘤研究中發現，核轉錄共抑制因子SnoN(Ski－related novel protein N)是該信號通路的重要負性調控因子，可嚴格調控TGF－β1/Smad信號的活性。我們前期的研究發現在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發病的前8周SnoN蛋白表達減少［2］，但有關SnoN蛋白和mRNA隨DN病程延長的動態表達情況及SnoN蛋白表達的調控機制目前尚不清楚。Smad泛素化調節因子2(Smad ubiquitin regulatory factor 2，Smurf 2)是一種E3泛素連接酶，它通過介導Smad信號通路的負調節因子SnoN和Smad7蛋白的降解，在TGF－β1/Smad信號的調節中起著重要作用。已有研究發現，在梗阻性(unilateral ureteral obstruction，UUO)腎纖維化模型中Smurf 2的表達與SnoN蛋白降解之間存在著密切的相關性［3］。但有關DN腎纖維化發生發展中Smurf 2的表達情況及其是否參與了SnoN蛋白的泛素化降解過程，尚未見報道。因此，本研究動態觀察了DN發生發展過程中Smurf 2蛋白和mRNA的表達情況，并初步探討其與SnoN蛋白降解的關系。

材料和方法

1 材料

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma);SnoN和Smurf 2兔多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology);磷酸化Smad2(p－Smad2)Ⅰ抗(Cell Signaling Technology);TGF－β1兔多克隆抗體和β－actin小鼠單克隆抗體，SABC－FITC試劑盒及生物素標記的鼠抗IgG、兔抗IgG(博士德公司);胰島素兔多克隆抗體(博奧森生物技術有限公司);ECL顯色劑(Pierce Biotechnology);總RNA提取試劑盒(Trizol法)、2×Taq PCR MasterMix及DNA MarkerⅠ(天根生化科技有限公司);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(MBI Fermentas);Smurf 2、SnoN及 β－actin引物(上海生工合成)。

2 方法

2.1 動物模型及分組 健康清潔級雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠［上海西普爾－比凱實驗動物有限公司提供，許可證號為 SCXY(滬)2003－0002］，體重(180±20)g。按55 mg/kg STZ尾靜脈注射復制DM大鼠模型，48 h后測空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L且尿糖陽性者作為糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠，隨機分成 DM 2、4、8、12、16 和 24 周組，每一時點均設鼠齡匹配的正常對照組(n=6)。各組大鼠均予自來水、標準飼料喂養，并在每個時點處死動物。于處死前1 d稱體重，代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量。股動脈取血收集血清，－20℃保存;處死大鼠，取胰腺和腎組織，稱腎重，于4%多聚甲醛固定和－80℃保存。以腎重(mg)與體重(g)比值作為腎臟指數。

2.2 生化指標測定 考馬斯亮藍法測尿蛋白，氧化酶(glucose oxidase－peroxidase，GOD －PAP)法測血清葡萄糖，苦味酸法測血清肌酐，均按試劑說明書操作。

2.3 組織病理觀察 將多聚甲醛固定的胰腺和腎組織制成3 μL厚石蠟切片，行HE染色和免疫熒光SABC法觀察各組胰腺組織胰島素(Ⅰ抗濃度為1∶200)的表達，光鏡下觀察胰腺和腎組織形態結構變化。

2.4 免疫熒光檢測SnoN和Smurf 2蛋白的表達部位 石蠟切片行免疫熒光SABC法檢測，SnoN和Smurf 2蛋白Ⅰ抗濃度均為1∶100，陰性對照用PBS代替Ⅰ抗。用LEICA DMLS型熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

2.5 免疫印跡檢測 SnoN、Smurf 2、TGF－β1及 p－Smad2蛋白表達量 以組織裂解液提取腎皮質總蛋白，考馬斯亮藍法測提取蛋白濃度。每泳道40 μg蛋白上樣，行SDS－PAGE垂直電泳，電轉移至PVDF膜。TBST沖洗，脫脂奶粉封閉。然后將膜放入稀釋的Ⅰ抗(SnoN、Smurf 2、TGF －β1、p－Smad2、β －actin稀釋倍數分別為 1∶400、1∶200、1∶100、1∶800、1∶400)，4℃過夜。第2 d，TBST沖洗后，將膜放入相應的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(稀釋倍數均為1∶9000)，室溫孵育2 h，TBST沖洗后 ECL顯影曝光。Bio－Rad凝膠成像系統掃描，Quantity One軟件分析各陽性條帶的積分灰度值，設內參照β－actin，計算各目標蛋白的相對含量。

2.6 RT－PCR檢測Smurf 2和SnoN mRNA的表達取約50 mg腎皮質，Trizol法提取總RNA，核酸蛋白儀測RNA濃度和純度(260 nm/280 nm比值均在1.8－2.0之間)。引物序列如下:Smurf 2正義鏈5'－GGGAACGCCCAACAAGAC－3'，反義鏈 5'－ATT-GCGGATCTCCCACCC －3'，產物306 bp，相應 β －actin正義鏈 5'－GAAATCGTGCGTGACATTAAG－3'，反義鏈5'－CTAGAAGCATTTGCGGTGGA －3'，產物490 bp;SnoN正義鏈5'－GAAAACCTCCAGTCTAAGTTCTCCTTAGTT－3'，反義鏈 5'－ATGAAGCTGGTCTGAAGTACACCTTGAACA － 3'，產物 500 bp;相應β－actin正義鏈5'－TGGCATTGTGATGGACTC－3'，反義鏈 5'－ CCGATAGTGATGACCTGAC －3'，產物306 bp。取5 μg腎組織總RNA配制逆轉錄反應體系，逆轉錄條件70℃ 5 min、37℃ 5 min，置冰上加入M －MULV 1 μL，42 ℃ 60 min，合成 cDNA，放 －20 ℃冰箱保存備用。PCR擴增條件:94℃預變性5 min，94℃變性45 s，Smurf 2和490 bp β－actin引物54.5℃退 火 45 s，SnoN 和 306 bp β －actin引 物58.3℃退火45s，72℃延伸1min，40個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio－Rad凝膠成像系統掃描，Quantity One軟件分析各條帶積分吸光度值，Smurf 2和SnoN mRNA的相對量分別用 Smurf 2/β －actin、SnoN/β －actin的積分吸光度值表示。

3 統計學處理

實驗結果采用SPSS 11.5統計軟件分析，數據以均數±標準差()表示。單因素方差分析對多組均數做顯著性檢驗，組間比較用q檢驗。Bivariate Correlations進行相關性分析。

結 果

1 血糖、血肌酐、24 h尿蛋白和腎臟指數

DM組各時點的血糖、血肌酐(Scr)、24 h尿蛋白、腎臟指數均顯著高于對照組，見表1。

表1 正常和糖尿病各組血糖、血肌酐、24 h尿蛋白量及腎臟指數的變化Table 1.Changes of blood glucose，Scr，24 h urine protein and kidney index in normal control(C)and diabetes(DM)groups(.n=6)

表1 正常和糖尿病各組血糖、血肌酐、24 h尿蛋白量及腎臟指數的變化Table 1.Changes of blood glucose，Scr，24 h urine protein and kidney index in normal control(C)and diabetes(DM)groups(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs Control group.

Group Blood glucose(mmol/L) Scr(μmol/L) 24 h urine protein(mg) Kidney index(mg/g)2 weeks C 6.72 ±2.42 58.86 ±7.40 2.01 ±1.21 7.11±0.48 DM 20.42 ±5.11＊＊ 71.37 ±7.62* 22.36 ±8.91＊＊ 11.27 ±0.58*4 weeks C 7.61 ±0.55 53.21 ±3.21 5.28 ±2.31 7.23 ±0.58 DM 24.07 ±3.52＊＊ 72.55 ±5.36* 32.30 ±8.35＊＊ 12.02 ±0.83＊＊8 weeks C 7.89 ±1.34 54.93 ±7.59 7.73 ±1.22 5.91 ±0.41 DM 26.36 ±2.02＊＊ 99.23 ±12.11＊＊ 27.26 ±8.51＊＊ 13.21 ±1.59＊＊12 weeks C 7.00 ±0.71 51.14 ±10.43 3.41 ±1.71 5.69 ±0.52 DM 23.43 ±2.56＊＊ 97.80 ±21.87＊＊ 22.10 ±7.31＊＊ 12.59 ±2.46＊＊16 weeks C 8.04 ±0.32 73.46 ±12.68 6.65 ±1.24 5.64 ±0.26 DM 27.15 ±1.20＊＊ 118.07 ±11.88＊＊ 26.38 ±18.34＊＊ 10.39 ±0.79＊＊24 weeks C 7.95 ±1.09 89.72 ±8.13 3.76 ±1.19 5.63 ±0.38 DM 23.33 ±2.63＊＊ 116.37 ±38.28＊＊ 49.35 ±31.86＊＊ 10.27 ±0.93＊＊

2 胰腺形態學觀察

HE染色顯微鏡下觀察正常大鼠胰島呈圓形或橢圓形的細胞團，各DM組胰島數量明顯減少，殘存的胰島成萎縮狀，胰島細胞數量減少，見圖1。免疫熒光染色可見正常大鼠胰腺組織胰島素表達較強，DM組胰島素表達明顯減弱，見圖2。

Figure 1.Histological changes of pancreas in control and diabetic rats(hematoxylin and eosin staining(×400).A:control group;B:diabetic group.圖1 正常對照組和糖尿病組大鼠胰腺組織形態學

Figure 2.Expression of insulin in the pancreas in control and diabetic rats(SABC －FITC，×400).A:control group;B:diabetic group.圖2 正常對照組和糖尿病組大鼠胰腺胰島素的表達

3 腎組織病理變化

HE染色可見正常大鼠腎小管結構清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，基底膜完整，間質中未見炎細胞浸潤。DM 4周組即可見腎小管上皮細胞變性，部分腎小管管腔擴張，間質有炎細胞浸潤，且隨病程進展病變逐漸加重，見圖3。

4 免疫熒光

圖4可見，SnoN和Smurf 2蛋白在大鼠腎組織中主要表達于腎小管上皮細胞和腎間質細胞。

Figure 3.Histological changes of kidney in control and diabetic rats(hematoxylin and eosin staining，×400).A:control group;B:diabetic group.圖3 正常對照組和糖尿病組大鼠腎組織形態學

Figure 4.Expression of SnoN and Smurf 2 protein in the kidney of rats(SABC－FITC，×400).A:negative control;B:SnoN;C:Smurf 2.圖4 SnoN和Smurf 2蛋白在大鼠腎組織的表達

5 免疫印跡結果

正常組及DM組每個時點各取6只大鼠的Western blotting結果進行統計學分析，以內參β－actin校正后，DM 2周SnoN蛋白的表達與正常組相比無差異，DM 4周起表達明顯減少，DM 12周組表達最少，為正常組的50.70%，之后持續在較低水平，見圖5。

Smurf 2和p－Smad2蛋白在正常組有少量表達，DM 2周組表達即明顯增多，并隨病程進展逐漸增多，DM 12周表達最多，之后持續在較高水平，見圖5。

對42只大鼠腎皮質中SnoN和Smurf 2蛋白的表達量進行相關性分析，結果顯示:r=－0.88，P＜0.01，可見，SnoN和Smurf 2蛋白的表達量高度負相關。

Figure 5.The levels of SnoN，Smurf 2，TGF－β1and p－Smad2 protein in kidney of control and DM rats.A:Western blotting analysis of renal SnoN，Smurf 2，TGF － β1and p－Smad2.Representative Western blotting show one animal per time point.B:graphical presentations show the relative abundance of SnoN，Smurf 2，TGF － β1and p－Smad2 at different time points after normalization with β－actin..n=6.*P＜0.05，#P＜0.01 vs control group.圖5 蛋白印跡顯示正常組及糖尿病各組SnoN、TGF－β1及Smad2/3的表達

與正常組相比，DM 2周組TGF－β1蛋白表達即明顯增多，并隨病程進展表達逐漸增多，見圖5。

6 RT－PCR結果

圖6所示，對照組大鼠腎皮質可檢測到Smurf 2 mRNA表達，DM 4周組起表達較對照組顯著增多(P＜0.01)，且隨病程延長而遞增。各DM組與正常對照組相比，SnoN mRNA的表達量無顯著差異(P＞0.05)。

討 論

本研究用STZ成功復制了大鼠DM模型。胰島病理觀察可見DM大鼠胰島縮小，β細胞數量減少，胰島素分泌減少，整個實驗期間大鼠血糖持續在高水平。從DM 2周起大鼠血肌酐和24 h尿蛋白增高并出現了腎臟病理改變，表明并發了DN。

Figure 6.SnoN and Smurf 2 mRNA levels in kidney from rats in different groups.A:RT－PCR analysis displays little change in SnoN mRNA levels in the DM kidneys after streptozotocin injectin.B:RT － PCR analysis shows the induction of Smurf 2 mRNA expression in the DM kidneys after streptozotocin injectin in a time－dependent manner.Representative RT － PCR bands show one animal per time point.C:graphical presentations show the relative abundance of SnoN and Smurf 2 mRNA abundance after normalization with β － actin..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.圖6 各組大鼠腎組織中SnoN和Smurf 2 mRNA的水平

TGF－β1作為DN多種致病因素的交匯點，可通過其下游Smads信號蛋白調控腎小管－間質纖維化發病過程，在DN進行性發展中發揮重要作用。核轉錄共抑制因子SnoN是TGF－β1/Smad信號通路中重要的負性調節因子，在細胞核和細胞漿中它可以通過不同的機制阻斷TGF－β1/Smad信號通路的信息傳遞［4－6］。我們之前的研究發現，DM發病的前8周，隨病程進展腎組織SnoN蛋白表達減少［2］。本研究持續觀察至DM 24周，發現DM 8周后，DM各組SnoN蛋白的表達仍明顯少于正常對照組;而DM各組SnoN mRNA的表達量與正常對照組相比均無差異;提示SnoN蛋白的表達減少可能參與了DN的發病過程，但它的表達減少并不是由其基因轉錄改變引起的。近期有研究發現SnoN蛋白的表達減少在UUO所致腎纖維化的發病機制中起著重要作用，且Smurf 2介導的泛素化降解與SnoN蛋白的表達減少密切相關，提示泛素化降解SnoN增加可能是導致腎纖維化的重要原因［7］。

泛素－蛋白酶體依賴性途徑介導的蛋白水解系統是由一系列高度組織的酶級聯反應組成，主要包括泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)和泛素連接酶(E3)三類酶［8，9］。其中，由于 E3 連接酶決定了降解底物蛋白的特異性和選擇性，因此在泛素－蛋白酶體途徑中起著決定性作用［9］。Smurf 2是一種HECT(與E6－AP羧基端同源)型E3連接酶，由1個氨基末端可與磷脂/鈣結合的C2結構域、3個WW結構域和1個羧基末端的HECT連接酶結構域組成，它與 TGF－β1/Smad信號通路中的 SnoN、Smad7和Smad2等蛋白的降解均有關［10］。目前有關泛素－蛋白酶體在DM并發癥發病中的研究尚少，偶有報道其與DM神經病變和視網膜病變的發病有關［11］。

本研究顯示，在正常大鼠腎組織中有少量Smurf 2蛋白的表達，DM 2周時表達已明顯增多，并隨病程進展逐漸增加，DM 12周達最高，之后持續在較高水平。Tan等［6］研究亦發現，在糖尿病伴局灶節段性腎小球硬化病人腎組織中Smurf 2蛋白表達增加，但其作用及原因未明，提示Smurf 2蛋白的表達變化可能參與了DN的發病過程。研究發現，磷酸化的Smad2通過其氨基端和連接區的PPXY結構與Smurf 2的WW結構域相互作用，可介導SnoN蛋白的泛素化降解［12］。本研究還觀察到，DN發病過程中TGF－β1表達增多，被它磷酸化的Smad2也相應增加，且磷酸化Smad2和Smurf 2蛋白的增多均早于SnoN蛋白的減少，并且Smurf 2和SnoN蛋白的表達量呈高度負相關，且二者表達部位一致，主要表達于腎小管上皮及腎小管間質細胞。以上結果提示，在DN發病過程中SnoN蛋白表達減少可能與Smurf 2介導其泛素化降解有關，表達增多的Smurf 2可能通過降解TGF－β1/Smad信號通路的重要負調控因子SnoN，在DN腎纖維化的發生和發展中起著重要的作用。

雖然泛素－蛋白酶體依賴型降解途徑在許多生理學功能中均發揮作用，E3連接酶Smurf 2的生物學功能除了可降解TGF－β1/Smad信號通路中的SnoN蛋白，還與Smad 7、Smad 2和β－catenin等蛋白的降解有關。但近期的研究表明，在UUO所致腎纖維化疾病的發生發展中，Smurf 2的最終作用是增強TGF－β1/Smad信號通路的活性，且TGF－β1可通過PI3K/AKT信號通路刺激 Smurf 2的表達［13］。我們的研究發現，隨著DN病程進展Smurf 2 mRNA表達增多，這是否與PI3K/AKT通路激活有關，有待進一步研究。

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