腎素前體激活人腎系膜細胞ERK1/2誘導(dǎo)TGF－β的表達*

宋瑋， 陳佳， 張英， 任麗麗， 米芋枚， 路巖， 姜一農(nóng)

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 大連 116027)

Nguyen等［1］于2002年首次報道在腎系膜細胞克隆出了腎素(前體)受體，迄今為止已克隆出了2種受體。其中6磷酸甘露糖/胰島素樣生長因子Ⅱ受體［mannose－6－phosphate/insulin like growth fac-torⅡ(IGFⅡ)receptor，M6P/IGF2R］被認為是prorenin的清除機制。Prorenin與之結(jié)合后產(chǎn)生一種內(nèi)化效應(yīng)被降解，M6P/IGF2R決定了細胞外prorenin的水平［1］。另一種是功能型的受體腎素(前體)受體［(pro)renin receptor，(P)RR］，這種受體是含有350個氨基酸的蛋白質(zhì)，具有1個跨膜區(qū)域，與其它的已知蛋白沒有同源性，在物種之間有高度保守性［1］。Nguyen最初以免疫熒光方法觀察到(P)RR存在于腎系膜細胞、冠狀動脈和腎動脈平滑肌細胞中，目前認為在心臟、腎臟、腦和胎盤組織(P)RR mRNA均以高水平表達［2］。(P)RR過度激活后參與激活細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)一些基因表達，同時增強(pro)renin的酶活性［3］。隨著人們對RAS系統(tǒng)的深入研究，(P)RR已經(jīng)成為伴有RAS系統(tǒng)過度激活相關(guān)腎病的熱點問題之一。

Prorenin的前肽片段包含一控制區(qū)域(handle region)，此控制區(qū)域是與受體結(jié)合的部位。人們依據(jù)prorenin前肽片段與受體結(jié)合的關(guān)鍵部位的氨基酸序列，設(shè)計出了1個肽片段，利用生物技術(shù)合成了十肽片段HRP(handle region peptide)。HRP模仿控制區(qū)域的序列，競爭性與受體結(jié)合［4］，故被認為是(P)RR的阻斷劑，但目前還沒有確切的證據(jù)證明。

(P)RR在物種間具有高度保守性［1］，目前雖然已有許多動物模型實驗證據(jù)證明(P)RR在心肌纖維化、腎小球硬化中發(fā)揮著獨立的病理作用，但尚無(P)RR在人類各臟器致病作用的報道。腎系膜細胞(human renal mesangial cells，HRMCs)增殖是高血壓腎病和糖尿病腎病的共同特點，其增殖和內(nèi)分泌功能在高血壓腎病和糖尿病腎病發(fā)展中起著重要的作用。本研究旨在觀察prorenin對體外培養(yǎng)的人腎系膜細胞ERK 1/2信號通道的活化作用及促纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子(transfer growth factor－β，TGF－β)表達的影響，并通過p－ERK 1/2和TGF－β的水平研究HRP是否具有(P)RR的阻斷作用。

材料和方法

1 材料

Prorenin購自Sigma。HRMCs及MCM培養(yǎng)液購自ScienCell。TGF－β ELISA試劑盒購自武漢博士德有限公司。細胞總RNA提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司。TGF－β PCR試劑盒及引物購自中國大連TaKaRa生物工程有限公司。兔抗人p－ERK、ERK抗體，羊抗兔－HRP抗體購自Santa Cruz。

2 HRMCs的培養(yǎng)

按照HRMCs說明書培養(yǎng)于MCM培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件37℃、5%CO2。細胞長至80% －90%，棄培養(yǎng)液，加入0.025%胰蛋白酶37℃消化1－2 min，顯微鏡下觀察，大部分細胞變圓近脫壁時，加入含10%FBS的培養(yǎng)液終止反應(yīng)，收集細胞懸液至離心管中，1000 r/min離心5 min。棄上清，加入MCM培養(yǎng)液制成細胞懸液，計數(shù)后接種至新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，取3－6代實驗用。

3 測定培養(yǎng)液中TGF－β

采用雙抗體夾心ELISA法。將標準品和樣品加入包被TGF－β單抗的酶標板上，按試劑盒操作。反應(yīng)終止后，在492 nm處測A值，TGF－β濃度與A值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中TGF－β濃度。

4 TGF－β mRNA表達測定

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR)方法。

4.1 細胞 RNA抽提 按照 Trizol說明書提取HRMCs的總RNA，溶于20 μL DEPC水中，用紫外分光光度計測定A260/280比值(為1.8－2.0)，測定濃度后保存于－70℃。

4.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) RNA 樣品1 μg、100 mg/L Oligo(dT)18.2 μL，加 DEPC 水至 10 μL，80 ℃ 加熱變性5 min。取出置冰上，再加入M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U、5 × 緩沖液 4 μL、10 mmol/L dNTPmix 2 μL、RNA酶抑制劑20 U，補DEPC水至20 μL，將上面2個步驟的液體混勻，37℃反應(yīng)1 h;95℃反應(yīng)3 min。將所有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于－20℃ 保存。

4.3 PCR 擴增反應(yīng) cDNA 2 μL、Taq 酶 1 μL、dNTP(10 mmol/L)1.5 μL、MgCl2(25 mmol/L)3.6 μL、10×PCR 緩沖液 3 μL、TGF－ β 或 β －actin上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，補三蒸水至 25 μL。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性94℃ 2 min;94℃45 s、72 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，循環(huán) 20次;72 ℃7 min。用β－actin作為內(nèi)參照。人TGF－β:上游引物5'－ GCATGGAGTOCTGTGGCAT －3'，下游引物5'－CTAGAAGCATTTGCGGTGG －3';β －actin上游引物5'－CCGCAAGGACCTCGGCTGGAA －3'，下游引物5'－GATCATGTTGGACAGCGCTC －3'。

4.4 cDNA電泳 所有PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描，軟件分析，并計算目的基因/β－actin吸光度(A)的比值。

5 p－ERK蛋白表達水平的測定

用Western blotting方法檢測。

5.1 總蛋白提取及濃度測定 用預(yù)冷的PBS液輕洗細胞3次后加入2×SDS凝膠加樣緩沖液，搖床上搖動15 min，用細胞刮刀刮下細胞殘片后將其轉(zhuǎn)移至EP管中，冰上孵育15 min，置于沸水中煮沸約5 min。將蛋白裂解液4℃、12000 r/min離心10 min，上清分裝至EP管中，按照BCA法測定蛋白濃度。

5.2 Western blotting 蛋白上樣 40 μg，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白條帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉 TBS－T溶液(20 mmol/L Tris、137 mmol/L NaCl、0.1%Tween－20)用于封閉和稀釋Ⅰ抗，37 ℃封閉3 h后，Ⅰ抗4℃孵育過夜，用1×TBS－T溶液洗膜4×10 min。孵育Ⅱ抗，室溫45 min，1×TBS－T溶液洗膜4×10 min。用ECL試劑檢測，感光膠片成像。用凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Lab－work軟件進行灰度分析。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 不同濃度prorenin對p－ERK1/2表達的影響

結(jié)果表明，prorenin濃度為5×10－10mol/L時，ERK1/2磷酸化與空白對照組比較顯著差異。5×10－9mol/L濃度時ERK1/2磷酸化程度最強，見圖1。后續(xù)實驗prorenin濃度均選用5×10－9mol/L。

2 不同時點prorenin刺激對p－ERK1/2表達的影響

結(jié)果表明，prorenin能夠使 ERK1/2快速磷酸化，最早出現(xiàn)于作用后 5 min，10、20、35 min ERK1/2磷酸化程度逐漸增強，35 min后不再改變。此后對p－ERK1/2觀察的時點選取35 min，見圖2。

3 PD98059和HRP對p－ERK蛋白表達的影響

結(jié)果可見，prorenin可通過激活(P)RR導(dǎo)致信號通道蛋白ERK1/2磷酸化增強，這種作用可被信號通道阻斷劑PD98059抑制，但不能被HRP抑制，見圖3。

Figure 1.Effect of prorenin at different concentrations on p－ERK1/2 in HRMCs.The bar chart shows the relative density of p－ERK1/2 to ERK1/2..n=3*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(C).圖1 不同濃度prorenin對p－ERK1/2表達的影響

Figure 2.The effect of prorenin at different time points on p－ERK in HRMCs.Time course of p－ERK1/2 after addition of human prorenin at 5×10－9mol/L was measured using Western blotting.The bar chart represents the density of p－ERK1/2 to ERK1/2..n=3.#P ＜ 0.01 vs control(C).圖2 不同時點prorenin刺激對p－ERK1/2表達的影響

Figure 3.The effects of prorenin，HRP and inhibitor of ERK1/2 on p － ERK1/2 in HRMCs.HRMCs were pretreated with the AT1blocker olmsartan(Olm)and the AT2 blocker PD123319 both at 10－5mol/L，and then coincubated with other reagents.Western blotting was preformed.The bar chart shows the relative levels of p－ERK1/2 to ERK1/2 in each group..n=3.##P ＜0.01 vs control.C:control;N:no addition.圖3 Prorenin、ERK1/2抑制劑 PD98059和 HRP對 p－ERK蛋白表達的影響

4 PD98059和HRP對TGF－β蛋白表達的影響

結(jié)果可見，prorenin可通過激活(P)RR導(dǎo)致TGF－β蛋白表達增高，ERK1/2信號通道阻斷劑PD98059能夠抑制TGF－β的表達，但HRP不能抑制prorenin上調(diào)TGF－β的作用，見圖4。

Figure 4.The effects of prorenin，HRP and inhibitor of ERK1/2 on TGF － β production in HRMCs.HRMCs were pretreated as mentioned above.The bar chart shows the protein levels of TGF－β evaluated by ELISA in each group..n=4.##P＜0.01 vs control(C).N:no addition.圖4 Prorenin、ERK1/2抑制劑PD98059和HRP對TGF－β蛋白表達的影響

5 PD98059和HRP對TGF－β mRNA表達的影響

結(jié)果可見，TGF－β mRNA水平與其蛋白水平相一致，即prorenin可通過激活(P)RR導(dǎo)致TGF－β mRNA水平上調(diào)，這種作用可被信號通道阻斷劑PD98059抑制，但不能被HRP抑制，見圖5。

討 論

高血壓腎損傷早期多表現(xiàn)為腎小球肥大、系膜細胞增殖［5］。本研究以不同濃度的prorenin刺激體外培養(yǎng)的HRMCs，發(fā)現(xiàn)prorenin使HRMCs的ERK1/2磷酸化增強，且ERK1/2磷酸化程度依賴于prorenin的濃度。有動物實驗證實ERK1/2的磷酸化可能參與腎病的發(fā)生發(fā)展［6］。

Prorenin促進ERK1/2磷酸化理論上有二種途徑。其一，HRMCs能夠合成血管緊張素原，prorenin與(P)RR結(jié)合，發(fā)揮蛋白水解酶作用，使血管緊張素原轉(zhuǎn)化成AngⅠ，繼而生成AngⅡ，導(dǎo)致ERK1/2磷酸化增強;其二，prorenin激活(P)RR，通過受體直接活化ERK1/2。為確認ERK1/2磷酸化的途徑，我們阻斷了 AT1和 AT2，以 prorenin干預(yù)細胞后，發(fā)現(xiàn)ERK1/2磷酸化仍增強，而以ERK1/2信號通道阻斷劑PD98059阻斷ERK1/2后，p－ERK1/2降低。由此可見，ERK1/2磷酸化是由于(P)RR過度激活的直接效應(yīng)，而并非依賴于AngⅡ的生成。

Figure 5.The effects of prorenin，HRP and inhibitor of ERK1/2 on TGF － β mRNA expression in HRMCs.HRMCs were pretreated as mentioned above.RT－PCR was preformed.The bar chart shows the relative mRNA levels of TGF － β to β － actin in each group.n=1.C:control;N:no addition.圖5 Prorenin、ERK1/2抑制劑PD98059和HRP對TGF－β mRNA表達的影響

我們同時觀察到:prorenin刺激細胞后，系膜細胞分泌TGF－β增多;而ERK1/2信號通道阻斷劑可以阻斷該作用，使TGF－β蛋白和mRNA水平下降。這說明TGF－β的調(diào)控依賴于ERK1/2信號通路。研究證實TGF－β在各種進行性腎臟纖維化疾病發(fā)展中起重要作用，是引起腎小球硬化的主要介質(zhì)，抑制TGF－β的增高可預(yù)防和延緩高血壓腎病的發(fā)生、發(fā)展過程［7］。

HRP是根據(jù)prorenin前肽片段氨基酸序列合成的十肽片段。我們發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的HRMCs中，HRP并不能阻斷 prorenin激活(P)RR所誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化，也不能抑制TGF－β的蛋白表達及mRNA的上調(diào)。盡管我們提高HRP的濃度，結(jié)果仍然如此。因此我們認為，HRP對體外培養(yǎng)的HRMCs沒有(P)RR 的阻斷作用。Ichihara 等［8－10］報道，在動物模型中，HRP能夠阻斷(P)RR，從而延緩腎小球硬化進展，逆轉(zhuǎn)心肌纖維化［11］。但在人平滑肌細胞和單核細胞中，HRP不能阻斷(P)RR激活所致的病理作用［12－14］;在高血壓鼠模型中，HRP并不影響心肌肥厚和腎損害的進展［15］。有學(xué)者認為，HRP在不同的研究中對(P)RR的阻斷作用不盡相同是由于動物模型中循環(huán)prorenin的水平不一致。由于上述觀點的爭議，HRP是否是(P)RR的阻斷劑尚無定論。

通過上述研究我們發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的HRMCs中，prorenin能夠激活(P)RR，使ERK1/2活化，從而導(dǎo)致TGF－β的mRNA表達上調(diào)，TGF－β蛋白表達增高，這種機制可能參與并加速腎小球硬化的發(fā)展進程。目前臨床上應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(angiotensinⅡreceptor blocker，ARB)類藥物對于改善蛋白尿、腎小球硬化雖有可觀的療效，但長期應(yīng)用可導(dǎo)致血漿腎素活性(plasma renin activity，PRA)增強，而腎素可不依賴于AngⅡ直接激活(P)RR導(dǎo)致靶器官功能損害加重。因此，目前為止臨床用藥中無論ACEI、ARB、腎素抑制劑aliskiren或HRP均不能阻斷(P)RR過度激活的病理作用，(P)RR仍然是藥物作用的盲區(qū)。期待將來會出現(xiàn)有效的(P)RR阻斷劑，能在RAS系統(tǒng)上游更有效地阻斷RAS系統(tǒng)的病理作用，對伴有RAS系統(tǒng)過度激活的心、腎及血管疾病帶來更多的獲益。

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