丹酚酸B對活化的系膜細胞TGF－β1受體和Smad2表達的影響*

劉煜敏， 張 悅△，陸海英， 郝艷鵬， 陸敏

(上海中醫(yī)藥大學1科技實驗中心，2護理學院，上海 201203)

丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是從臨床常用的活血化瘀中藥丹參中提取的水溶性成分，整體動物實驗表明，Sal B 具有一定的抗肝、腎纖維化作用［1，2］，但其具體作用環(huán)節(jié)尚不清楚。在腎纖維化的腎小球部位，活化的系膜細胞是產生細胞外基質的主要細胞。本研究以此作為切入點，觀察Sal B對活化系膜細胞的影響并結合腎纖維化中轉化生長因子－β(TGF－β)/Smad這一重要信號通路初步探討其作用機制。

材料和方法

1 藥品與試劑

Sal B購自中國藥品生物制品檢定所，批號為111562－200807;重組人轉化生長因子1(transforming growth factor－ β1，TGF － β1)購自 Millipore;DMEM高糖培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone;α－平滑肌肌動蛋白(α－smooth muscle actin，α－SMA)單抗購自Sigma;轉化生長因子Ⅰ型受體(TGF－β1receptorⅠ，TβRI)多抗、轉化生長因子Ⅱ型受體(TGF－β1receptorⅡ，TβRII)多抗購自Santa Cruz;磷酸化 Smad2單抗、Smad2單抗購自 Cell Signal;Smad7單抗購自R＆D;甘油醛－3－磷酸脫氫酶免疫球蛋白G偶聯(lián)辣根過氧化物酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase immunoglobulin G horse radish peroxidase，GAPDH IgG －HRP)單抗購自上海康成生物公司;預染蛋白標記物購自Fermentas;二喹林甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、化學發(fā)光底物(Super SignalWestern Pico chemiluminescent substrate，ECL)試劑盒購自 Pierce。

2 方法

2.1 大鼠腎小球系膜細胞培養(yǎng) 具體步驟參照參考文獻［3］。乙醚麻醉饑餓過夜雄性大鼠(150 g左右)，無菌操作取腎皮質，于Hank's液中洗滌后剪碎，過80目和150目篩網(wǎng)，下接200目篩網(wǎng)。用移液管從200目篩網(wǎng)上吸取腎小球，轉移到試管中。試管垂直靜置10－15 min使腎小球自然下沉后棄上清。加入IV型膠原酶，37℃消化20 min后棄上清。加入培養(yǎng)液10 mL，懸浮腎小球，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3－4 d內勿觸動培養(yǎng)瓶，此后每周換液2次，待80% －90%細胞融合后進行實驗。

2.2 蛋白免疫印跡分析 用上樣緩沖液裂解6孔板細胞，收集后煮沸變性10 min。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate － polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE)后轉移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，用含5%脫脂奶粉的Tris緩沖溶液(Tris buffer solution，TBS)室溫封閉1 h，然后分別加入 α －SMA 抗體(1∶3000)、TβRI抗體(1∶200)、TβRII抗體(1∶400)、p － Smad2(1∶1000)抗體、Smad2(1∶1000)抗體、Smad7 抗體(1∶1000)、GAPDH抗體(1∶5000)，4℃孵育過夜。洗膜后再用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的 IgGⅡ抗(1∶5000)雜交，室溫孵育1 h。再次洗膜后用ECL試劑顯色并曝光成像。利用圖像分析系統(tǒng)掃描確定X光片上的雜交條帶的吸光度值。

2.3 細胞免疫熒光染色 細胞培養(yǎng)于24孔板內無菌處理的蓋玻片上，各組干預結束，再用預冷PBS洗2遍后，再用預冷4%多聚甲醛固定10 min。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗2遍后用含0.5% 小牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS室溫封閉30 min，Ⅰ抗4℃孵育過夜，PBS洗3遍后用Alex 536抗小鼠熒光Ⅱ抗室溫標記1 h，PBS洗3遍后用含4’，6－二脒基 －2－苯基吲哚(4’，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI)的封片劑封片，避光自然干燥后熒光顯微鏡(Nikon E600FN)觀察。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 Sal B對系膜細胞活化的影響

Figure 1.Effect of Sal B on α － SMA expression in mesangial cells.A:control group;B:TGF － β1group;C:10－5 mol/L Sal B group;D:10－6mol/L Sal B group;E:TGF－β1+10－5mol/L Sal B group;F:TGF－β1+10 －6mol/L Sal B group.圖1 Sal B對系膜細胞α－SMA表達的影響

α－SMA蛋白明顯表達和系膜細胞胞體增大是系膜細胞活化的重要標志。圖1顯示，TGF－β1刺激系膜細胞24 h即可見顯著表達α－SMA及胞體增大表現(xiàn)，提示TGF－β1成功誘導系膜細胞活化。而在10－5mol/L和10－6mol/L Sal B組及其與 TGF－β1共刺激組均未見系膜細胞活化表現(xiàn)。

2 TGF－β1刺激系膜細胞活化對Smad2磷酸化及Smad7蛋白表達的影響

由圖2可見，隨TGF－β1刺激時間延長，Smad2分子呈現(xiàn)明顯磷酸化活化。與對照組比較，TGF－β1刺激系膜細胞 15 min、30 min、60 min、120 min、360 min均可見 Smad2顯著磷酸化(P＜0.05)。總Smad2和Smad7蛋白表達在TGF－β1刺激各時點未見明顯變化(P＞0.05)。

Figure 2.Effects of treatment for different time of 5 μg/L TGF －β1on Smad2 phosphorylation，Smad2 and Smad7 protein expression in mesangial cells.A:control group;B:TGF－β115min group;C:TGF－β130min group;D:TGF－β160min group;E:TGF－β1 120min group;F:TGF－β1360min group..n=4.*P ＜0.05 vs control group.圖2 TGF－β1刺激不同時點對系膜細胞Smad2磷酸化、Smad2、Smad7表達的影響

3 Sal B對系膜細胞TGF－β1兩型受體及Smad2磷酸化的影響

由圖3可知，TGF－β1刺激組TβRI表達(0.784±0.110)、TβRII表達(0.576 ±0.085)分別高于對照組(0.501±0.125)、(0.074±0.033)，且組間比較差異顯著(P＜0.05)。而Sal B可顯著抑制TGF－β1刺激引起的此兩型受體表達增多。由圖3可知，TGF－β1刺激后可引起系膜細胞Smad2顯著磷酸化(P＜0.05);而Sal B可抑制這種效應。但TGF－β1刺激和Sal B干預對于系膜細胞中Smad2分子的蛋白表達均未見顯著影響。

Figure 3.Effects of Sal B on TGF－β1receptors and Smad2 expression in mesangial cells.A:control group;B:TGF － β1group;C:10－5mol/L Sal B group;D:10－6mol/L Sal B group;E:TGF － β1+10－5mol/L Sal B group;F:TGF － β1+10－6mol/L Sal B group..n=6.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs TGF－β1group.圖3 Sal B對活化系膜細胞TβRI、TβRII、Smad2磷酸化及Smad2表達的影響

討 論

作為腎小球內的主要細胞類型之一，系膜細胞在維持基膜的更新與修復、調節(jié)腎小球血流量、支持毛細血管壁等方面發(fā)揮重要作用。包括TGF－β1和胰島素［4］在內的許多細胞因子以及高糖、高脂［5，6］等刺激都能調節(jié)系膜細胞由休眠向基質過度產生的活化狀態(tài)的表型轉化，促進細胞外基質的過度產生。系膜細胞的活化是以α－SMA表達誘導和基質過度產生為特點的［7］。在腎臟中，高親和力的TGF－β受體主要在小球上皮細胞(足細胞)和系膜細胞表達［8］。

腎小球系膜細胞活化是腎小球腎炎、糖尿病腎病、腎纖維化等多種腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中的共性事件。因此，抑制系膜細胞活化的研究也是治療這些腎臟病的一個切入點。Wang等［9］發(fā)現(xiàn)在系膜細胞中骨形成蛋白7(bone morphed protein，BMP－7)具有與TGF－β1相反的作用，主要是通過調控TGF－β/Smad通路實現(xiàn)的，不需要 Erk1/2、p38或JNK等信號參與。Dai等［10］研究表明在系膜細胞中，肝細胞生長因子能夠穩(wěn)定Smad轉錄共抑制子TGIF而特異性拮抗TGF－β1的促纖維化效應。

近年來對于小分子物質Sal B(分子量718)的藥理作用研究也不僅僅局限于其抗氧化作用。不斷有研究表明，Sal B對多種細胞在遭受刺激或損傷時均具有一定的保護作用。在神經(jīng)細胞缺糖缺氧/復糖復氧的損傷過程中，Sal B能夠維持鈣穩(wěn)態(tài)，提高基質金屬蛋白酶，降低細胞凋亡率［11］。Liu 等［12］的研究表明Sal B通過調控PI3K/Akt/Raf/MEK/ERK信號通路保護大鼠腦微血管內皮細胞免受H2O2誘導的凋亡。在系膜細胞中，Sal B能抑制呈劑量依賴性高糖誘導系膜細胞增殖與細胞外基質沉積，其作用機制是通過抑制NF－κB激活調控細胞周期進程和金屬基質蛋白酶活性而實現(xiàn)的［13］。

本研究首先對TGF－β1刺激系膜細胞后其表型轉化標志蛋白α－SMA的表達做一檢測，免疫熒光觀察結果與蛋白免疫印跡分析結果一致提示Sal B對TGF－β1刺激引起的系膜細胞活化有拮抗作用。然后分別檢測了TGF－β1激活系膜細胞后對Smad通路的受體型和抑制型Smad分子的影響，結果提示Smad2明顯磷酸化而活化，總Smad2和Smad7表達無顯著變化。隨后，本研究對Sal B抑制系膜細胞活化的機制做一簡單探討。實驗結果提示Sal B能夠抑制TGF－β1兩型受體表達和Smad2磷酸化活化。此前也已有體外實驗表明一些小分子天然產物，如姜黃素，具有拮抗腎臟細胞TGF－β1兩型受體表達從而減少細胞外基質成分沉積的作用［14］。

綜上所述，在TGF－β1刺激系膜細胞活化的病理過程中，Sal B能夠抑制 TβRI、TβRII表達，抑制TGF－β/Smad信號通路激活，拮抗系膜細胞活化。Sal B對系膜細胞內源性的TGF－β1兩型受體蛋白表達和Smad2磷酸化的抑制作用可能是其發(fā)揮抗腎纖維化作用的細胞學靶標之一。

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