瘦素抑制H2O2誘導的大鼠心肌細胞凋亡

潘 喆， 李曉博， 孫愛麗， 莊向華， 姜冬青， 劉元濤△， 姜兆順

(1山東大學第二醫院內分泌科，山東 濟南 250033;2濟南軍區總醫院內分泌科，山東 濟南 250031)

瘦素是肥胖基因(ob)的產物，主要由白色脂肪組織合成，其主要功能是通過與下丘腦的瘦素受體結合，影響神經肽Y等多種神經內分泌激素的分泌，導致攝食減少、耗能增加［1］。除了腦組織外，目前研究表明，肝臟、骨骼肌、心肌、腎臟等外周組織也存在瘦素受體［2，3］，提示瘦素可通過中樞及外周雙重作用調節機體的各種功能。心臟是瘦素的重要靶器官之一。研究發現，瘦素信號缺陷可導致心肌細胞凋亡增加，并且與慢性心衰的發生有密切關系，但確切機制尚不清楚［4］。自由基損傷是各種因素導致心肌損傷的共同機制之一，本文將通過體外心肌細胞培養，觀察瘦素對H2O2誘導的細胞凋亡的影響并初步探討其作用機制。

材料和方法

1 材料

Caspase－3單克隆抗體(識別全長及裂解的大片段)、磷酸化胞外信號調控激酶ERK1/2單克隆抗體(phos－extracellular signal－regulated kinase，p－ERK)(Cell Signaling Technology)。ERK1/2抗體(Pan－ERK)、辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗(Santa Cruz)，DMEM細胞培養液(Gibco)，細胞培養皿(BD)，TUNEL 試劑盒(Roche)，瘦素(Calbiochem)，PD98059(Cell Signaling Technology)，DAPI封片劑(Vector Laboratories)，其它材料來自Sigma。

2 方法

2.1 細胞培養 大鼠心室肌細胞H9c2細胞，培養于含10% 胎牛血清的DMEM培養液中，培養溫度為37℃、飽和濕度和5%CO2。實驗前，細胞于6孔板內培養至亞融合狀態，然后無血清培養4 h。為誘導凋亡，細胞分為:對照組、H2O2處理組、H2O2+瘦素組。H2O2終濃度400 μmol/L，處理時間為6 h。瘦素濃度為6 nmol/L(此濃度參考相關文獻，在生理濃度范圍內)預處理1 h并維持到 H2O2處理結束。PD98059抑制實驗，細胞分為:對照組、H2O2處理組、PD98059+H2O2組、PD98059+H2O2+瘦素組。細胞應用瘦素前，先用50 μmol/L PD98059預處理15 min。

2.2 細胞凋亡檢測 采用TUNEL試劑盒檢測。細胞經PBS沖洗，4℃條件下用4%甲醛固定15 min。PBS沖洗后，加2%Triton(溶于0.1%枸櫞酸鈉)，孵育5 min。TUNEL溶液室溫染色1 h，PBS沖洗后直接用含DAPI的封片劑封片。置于熒光顯微鏡下觀察并計算凋亡細胞陽性率。

2.3 Caspase－3、ERK1/2蛋白表達及活性測定采用Western blotting方法。細胞經處理后，用PBS沖洗2遍，冰上裂解(裂解液:20 mmol/L Tris－HCl，0.1 mmol/L Na3VO4，25 mmol/L/L NaF，25 mmol/L β－glycerophosphate，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，2 mg/L aprotinin，2 mg/L leupeptin，pH 7.5)。4℃條件下離心15 min(14000 r/min)，取上清并測定蛋白濃度(Bradford法)。取20 μg蛋白上樣、跑膠(12%SDS)并轉移到硝酸纖維素膜上，1%脫脂奶粉封閉1 h。Caspase－3、p－ERK、Pan－ERK1/2按1∶1000濃度雜交2 h。PBS充分洗膜后，1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗室溫雜交1 h。PBS洗膜，ECL顯色。Western blotting結果定量分析用 NIH ImageJ 1.42軟件進行。

3 統計學處理

結 果

1 瘦素對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡的影響

瘦素預處理組細胞凋亡率(36.0% ±3.6%)較H2O2單純處理組(56.0% ±3.6%)顯著降低(P＜0.05)，見圖 1。

Figure 1.The effect of leptin on H2O2－induced apoptosis in H9c2 cells..n=3.▲▲P＜0.01 vs H2O2group;#P ＜0.05 vs control.圖1 瘦素對H2O2誘導的H9c2細胞凋亡的影響的TUNEL染色分析

2 瘦素對caspase－3活性的影響

H2O2處理6 h，caspase－3活性明顯增加(蛋白裂解增加)。瘦素預處理1 h顯著抑制H2O2誘導的caspase－3激活，見圖2。以 cleaved caspase－3與T－caspase－3灰度比值作為casepase－3激活的指標進行定量分析。結果顯示:H2O2處理組caspase－3活性顯著高于對照組(P＜0.01);瘦素預處理組caspase－3活性較單純H2O2處理組顯著降低(P＜0.01)，見圖3。

Figure 2.Effects of leptin on caspase－3 activation.圖2 瘦素對caspase－3活性的影響

Figure 3.Quantitative analysis of the effect of leptin on caspase－3 activation..n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control;▲▲P ＜0.01 vs H2O2+leptin group.圖3 瘦素對caspase－3活性影響的定量分析

3 瘦素對ERK1/2活性的影響

H2O2處理15 min，可明顯抑制 ERK1(上帶)及ERK2(下帶)的活性(磷酸化);瘦素預處理1 h，明顯增加ERK1/2的基礎活性并部分阻斷H2O2誘導的ERK1/2活性下降，兩者對ERK1/2蛋白表達無明顯作用，見圖4。以p－ERK1/2與 Pan－ERK1/2灰度比值作為ERK激活的指標進行定量分析。結果顯示:瘦素處理組ERK活性顯著高于對照組(P＜0.05);而H2O2處理組ERK活性較對照組顯著降低(P＜0.01);瘦素預處理組ERK活性較單純H2O2處理組ERK活性顯著升高(P＜0.05)，見圖5。

Figure 4.Effects of leptin on ERK1/2 activation.圖4 瘦素對ERK1/2活性的影響

Figure 5.Quantitative analysis of the effect of leptin on ERK activation..n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control;▲P＜0.05 vs H2O2group.圖5 瘦素對caspase－3活性影響的定量分析

4 MEK抑制劑PD98059對瘦素保護作用的影響

PD98059+H2O2組細胞凋亡較單純H2O2處理組增加(57.2% ±3.2%vs 65.4% ±3.5%)，但差異無顯著(P＞0.05);PD98059+H2O2+瘦素組與PD98059+H2O2組比較，細胞凋亡率差異無顯著(60.8% ±4.0%vs 65.4% ±3.5%，P＞0.05)，見圖6。

Figure 6.Effect of MEK inhibitor PD98059 on the cytoprotective function of leptin..n=3.*P＜0.05 vs control.圖6 MEK抑制劑PD98059對瘦素保護作用的影響

討 論

作為肥胖基因(ob)的產物，瘦素的主要功能是通過與下丘腦的瘦素受體結合，控制進食并增加熱量消耗來調節動物體重［1］。近來發現，除了腦組織外，許多外周組織表達瘦素受體，其中心臟是瘦素作用的重要外周靶器官之一［5］。

體內實驗發現，無論是缺乏瘦素的ob/ob小鼠還是瘦素受體存在缺陷的 db/db小鼠，兩者心肌細胞凋亡較正常小鼠明顯增加，而給予ob/ob小鼠補充外源性瘦素則明顯降低細胞凋亡率［4］，提示瘦素對維持心肌細胞正常生存具有重要作用。在上述研究中，學者還發現ob/ob及db/db小鼠心肌細胞脂肪含量明顯增加，提示瘦素防止正常心肌細胞凋亡的機制是通過調節脂肪代謝、防止脂類物質的毒性作用而間接實現的。

自由基是各種誘因導致心肌細胞凋亡的共同機制之一。本文發現，應用 400 μmol/L H2O2處理H9c2細胞6 h，約56%細胞出現凋亡;而應用生理劑量的瘦素預處理1 h，可使凋亡細胞比例顯著降低。本研究結果提示瘦素不但通過改善脂代謝防止心肌細胞凋亡的發生，而且還可能對凋亡信號具有直接抑制作用。為了探討瘦素的對H2O2誘導的心肌細胞凋亡的保護機制，本研究觀察了其對細胞外信號調節激酶ERK活性的影響。ERK是絲裂素活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase)MAPKs的一個亞家族。在哺乳動物體內含有5種ERK，分別是ERK 1－5，最常見的ERK1/2的蛋白蘇氨酸及相鄰的酪氨酸殘基均在一個雙重特異性模序中分別由MEK1/2直接磷酸化［6，7］。有研究表明 ERK 對心肌缺血－再灌注導致的細胞損傷具有保護作用［8］。

已知，瘦素與其受體結合可激活ERK，這在多種細胞中已得到證實［2］。本研究發現，H2O2對 ERK活性的抑制作用，這可能是其造成細胞凋亡的機制之一;而瘦素不但直接激活ERK1/2，而且部分降低了H2O2對ERK活性的抑制，提示瘦素對H2O2誘導心肌細胞凋亡的保護作用可能與激活MAPK信號途徑有關。為了進一步證實以上結論，本研究觀察了ERK激酶MEK抑制劑PD98059對瘦素作用的影響，結果顯示瘦素的保護作用可被PD98059所阻斷。關于MAPK抑制凋亡的機制，目前還不完全清楚。有研究認為這可能與抑制促凋亡蛋白Bad的功能有關［9，10］，詳細機制有待進一步探討。

總之，本研究證實瘦素對自由基造成的心肌細胞凋亡具有抑制作用，其機制可能與激活MAPK信號途徑有關，但詳細機制尚有待于進一步闡明。值得注意的是，與本文所觀察的瘦素的對心肌細胞的直接效應不同，有研究發現瘦素可增加交感神經興奮性、誘導內皮自由基產生、促進血栓形成等機制，對心肌細胞具有間接的損傷作用［11］。如何有效利用瘦素的心肌保護作用，同時降低其對心肌的間接損害是未來臨床工作亟待解決的重要課題。

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