大鼠胃平滑肌細胞的體外分離與三維支架培養方法

鄭毅雄，張魯清，包 祺，陳 奇，姜 明，陳 力

（浙江大學醫學院附屬第二醫院外科，浙江杭州 310009）

全胃切除的患者常常會出現傾倒綜合征、反流性食管炎、營養不良和貧血等問題，使得患者的生活質量下降。盡管各種胃替代手術方法被用于臨床中，但是重建方式的有效性仍頗受爭議。新近的組織工程技術使得胃腸道的人工再造成為可能，研究表明，利用種子細胞、支架材料以及相應的生長因子構建有生物活性的胃腸道，能夠增加胃腸黏膜吸收面積，改善胃腸道功能[1-2]。因此，利用組織工程技術在體外形成胃組織進行體內再植，為解決全胃切除術后的營養吸收問題帶來了希望。

胃腸道平滑肌層對于胃腸的蠕動功能和病理生理機制具有十分重要的作用。因此，獲取大量高純度的胃腸平滑肌細胞是胃腸組織工程學的必要條件。本研究在顯微鏡下分離大鼠胃平滑肌，采用酶消化法獲取平滑肌細胞，建立穩定的胃平滑肌細胞體外擴增培養模型，并進一步探討其三維復合培養的可行性，從而為開展相關的組織工程研究打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料

150～200 g SD大鼠由浙江大學動物實驗中心提供，PLGA支架材料由浙江工業大學馮杰教授提供，高糖DMEM培養液（Gibco公司），新生小牛血清（杭州四季青生物技術研究所），胰蛋白酶（Gibco公司），Ⅰ型膠原酶（Sigma 公司），Tissucol凝血酶和纖維蛋白原（Baxter公司），兔抗鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（武漢博士德生物公司），碘化丙啶（PI）（Sigma 公司），二乙酸螢光素（FDA）（Sigma 公司），5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）（Sigma公司），恒溫二氧化碳細胞培養箱（Heraeus公司），倒置顯微鏡（IX70，Olympus公司），熒光顯微鏡（PROVIS AX70，Olympus公司）。

1.2 大鼠胃平滑肌細胞的分離和培養方法

無菌條件下剪取大鼠胃底，將剪下后的組織立即置于含青、鏈霉素的無菌Hanks液中，移入超凈工作臺內反復漂洗2～3次，在體視顯微鏡下仔細去除食物殘渣及內膜，翻轉至外側，小心地撕去腸系膜，再仔細地刮去漿膜層，直至余下的組織層在顯微鏡下觀察到呈透明的一層為止。以無菌的Hanks液沖洗3～4次，用眼科剪細剪成1 mm3的小塊后加入含0.2%Ⅰ型膠原酶的DMEM培養基3～5 ml，37℃振蕩消化4 h后離心（1000 r/min）1 min，棄上清再加入 0.05%胰蛋白酶37℃消化1 h，待消化液渾濁、組織塊呈絮狀提示消化良好。混懸液經過100目細胞篩過濾后再離心（1000 r/min）5 min，棄上清，將沉淀細胞輕輕吹打混勻后移入細胞培養瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%二氧化碳培養箱中半開放培養。一般24 h即可見細胞貼壁伸展，2～3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞長成單層和多層交錯的致密細胞層時（7 d左右）即可傳代培養。

1.3 平滑肌細胞的鑒定

1.3.1 細胞形態學觀察 根據平滑肌細胞的形態特點，倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態、生長特點和生長方式。

1.3.2 免疫組化染色鑒定 在進行第3代細胞傳代時，先將6孔培養皿底部放入蓋玻片，然后接種細胞于培養皿內，使細胞在蓋玻片上進行貼壁生長，當細胞進入對數生長期后，取出細胞爬片，PBS液清洗后用4℃的純丙酮固定15～30 min，自然晾干。采用抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體進行免疫組化染色分析。根據SP免疫組化染色的常規方法，顯微鏡下計數每個視野中染色陽性的細胞占所有細胞的比例，大于98%的平滑肌細胞胞漿棕黃色細絲為陽性結果。

1.4 三維PLGA復合物培養模型的建立

擴增的第三代細胞消化分離前24 h，向培養液中加入14%的BrdU孵育，標記細胞。收集足量的細胞，離心后制成細胞懸液，加入纖維蛋白原（1∶2）混勻，調整細胞濃度至25×106/ml，無菌條件下將消毒的PLGA支架（圓柱型，直徑8 mm，高2 mm）放入裝有細胞懸液的離心管中，材料充分吸附細胞懸液后，在PLGA支架中形成200 μl/cm3的細胞密度。分別在每個細胞-PLGA支架上滴上2滴凝血酶，37℃培養箱孵育30 min，使得細胞懸液在支架內聚合，構建成PC-PLGA復合物，該復合物轉移入含15%胎牛血清DMEM培養基的6孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱中，進行三維培養。每2天換液，7 d和14 d后取出復合物進行檢測。

1.5 PI/FDA細胞活性檢測

取出細胞-PLGA復合物，PBS洗2次，加FDA 3 ml，37℃培養箱中染色15 min。PBS清洗2次后，加PI避光條件下室溫染色2 min。PBS清洗后立即于熒光顯微鏡下觀察，不加染色劑的細胞作為對照。

2 結果

2.1 胃平滑肌細胞形態觀察

實驗發現，0.2%Ⅰ型膠原酶和0.05%胰酶混合裂解后，組織裂解充分均勻，細胞受損傷輕，接種成功率高。光學顯微鏡下觀察，一般24 h就能發現細胞附壁伸展。以平滑肌細胞為主的纖維樣細胞起始可有長短不一的數個細胞突起，呈短梭形，并相互接觸，細胞質透明，核卵圓形，居中，多數1個，少數多個，最后細胞逐漸伸展為梭形；密度低時細胞排列常呈網格狀排列，密度高時局部地方細胞重疊生長成多層，局部地方甚至沒有細胞長入，成典型的“峰-谷”樣生長（圖1）。1周左右細胞就能生長到進行細胞傳代的亞融合狀態，此時進行細胞傳代，傳代后12 h細胞開始貼壁生長，細胞形態正常、生長迅速，5～6 d后可進行下一次傳代。

2.2 免疫組織化學染色

特異的抗平滑肌α-SMA免疫組織化學染色后，胞質內可見與細胞長軸平行的纖維細絲，被染成棕黃色，即平滑肌α肌動蛋白絲，細胞平均陽性率≥98%。

2.3 三維PLGA復合物的觀察

2.3.1 倒置顯微鏡觀察 細胞接種24 h，細胞-PLGA復合物內可見均勻的細胞分布，周邊光線強的部分可見細胞呈圓形黏附于材料上，顯示了細胞與材料良好的相容性；中央部分光線較弱，僅見材料網狀結構（圖2）。

2.3.2 PI/FDA細胞活性檢測 熒光顯微鏡顯示，標記的擴增培養細胞均勻分布于材料中，14 d后細胞數目有所減少（圖3A）。PI/FDA細胞活性檢測顯示，7 d時，PLGA支架內細胞均勻分布，90%以上的細胞顯示綠色熒光，PLGA纖維仍保持完整，未顯示熒光染色。14 d時，細胞形態變為長方形或多邊形，存活率仍達90%左右，部分降解的PLGA被PI染成紅色（圖 3B）。

3 討論

組織工程學的進步為胃替代方法開啟了新的希望，美國Vacanti研究組在2003年開始報道從新生的大鼠中分離出胃上皮類器官單位，接種于管狀支架材料上，用于替代成年大鼠的胃[1]，雖然組織學上觀察到類似胃壁的上皮隱窩細胞構成的囊腔結構，但是這種方法很難在臨床上實現。其原因是：一方面，上皮類器官單位在體外培養基中存活的時間很短，最多24～48 h，之后就會出現退化和死亡；另一方面，構建足量的胃復合物需要取得大量的黏膜組織，在大動物實驗以及臨床中這是極難達到的[3]。

隨著對胃腸壁結構和功能的深入認識，人們發現哺乳動物腸黏膜上皮是機體代謝最為活躍的場所，體內腸黏膜上皮細胞的再生和適應能力非常強，終生進行著不間斷的自我更新[4]；但是，小腸黏膜上皮細胞以及隱窩干細胞的體外分離培養存在很大的困難。相反，成熟的平滑肌細胞在體內外可呈現出去分化的潛能，體外培養和擴增平滑肌細胞作為組織工程的種子細胞是切實可行的[5-6]。因此，建立簡單可靠的平滑肌細胞模型成為胃組織工程研究的基本要求。目前大鼠原代細胞培養有貼塊法和酶解離法。貼塊法的細胞生長周期長，細胞純化速度慢，且有一定的局限性。本文對酶解離法加以改進探索了一種比較簡便的膠原酶聯合胰酶的解離法，該方法成功地在體外培養了大鼠胃平滑肌細胞，且能在1～2周內獲得原代平滑肌細胞，還能較快地獲得較大量的種子細胞用于三維支架培養模型的建立，適合于臨床應用研究。

生物支架是構建組織工程替代物的另一個關鍵因素，本研究采用的組織工程復合物三維構建技術，已在在成骨組織工程的構建中被證明切實可行[7]。體外三維支架復合培養模型是將高濃度細胞接種在具有一定的支架材料上，在模擬體內的化學、物理和生物條件下進行培養，通過模擬在體細胞的生長、分化及代謝，直接觀察細胞與生物材料復合生長的情況，并能有效地檢測細胞的生理功能的變化，有利于了解細胞與材料的相互作用，有助于組織工程支架材料以及組織工程復合物的篩選。本文所采用的方法將細胞包埋于纖維蛋白膠作為細胞外基質，再同支架材料結合，使得細胞在支架中均勻分布和黏附[8]。纖維蛋白膠同時提供一種網狀立體支架，對細胞的生長起到支撐作用，使細胞能從三維方向與培養液充分接觸，有利于物質交換且可以進行物質和營養交換，亦有利于細胞沿纖維蛋白支架游走和聚集，從而形成特定的組織結構，構建的三維復合具有細胞分布均勻、提供細胞外基質、塑性容易的優點，因而適合在組織工程研究中推廣應用。

PI/FDA細胞活性是檢測三維復合物中細胞活性的可靠方法，細胞損傷的特征是失去漿膜的完整性。FDA可進入活細胞并被水解成游離熒光和醋酸鹽，游離熒光不可透過細胞膜，因而在有活力的細胞里獲得綠色熒光，而受損的細胞不顯示綠色熒光。相反，PI可跨越不完整的細胞膜，使得死亡或凋亡的細胞獲得紅色熒光。熒光標記和PI/FDA檢測方法可用于體外靜態培養和體內植入時觀察三維復合物中細胞的生理和代謝特征，有助于下一步用于研究三維平滑肌細胞復合物替代胃腸功能的評價。

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