主成分分析方法在食管癌患者血清代謝物研究中的應用

楊永霞 ，梁敏鋒 ，陳阿麗 ，丘翠環(huán) *，張 磊 ，吳懷選

（1.廣東藥學院基礎學院，廣東廣州 510006；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院感染內科，廣東廣州 510515；3.廣東藥學院中山校區(qū)實驗中心，廣東中山 528458）

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術作為一種無侵入、高效的分析手段已經成為代謝組學研究的重要實驗方法[1-3]，但生物樣品（體液、組織）組成復雜，通常高分辨一維1H譜就包含成百上千個的共振峰，即使是經驗豐富的波譜學家也很難從復雜的NMR譜中獲得全部的有用信息。因此，結合模式識別來分析NMR的實驗數(shù)據(jù)是非常有益的。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種在保持數(shù)據(jù)信息損失最少的原則下，對高維變量空間進行降維處理的線性映射方法[4]。本文應用高分辨核磁共振1H譜并結合主成分分析方法研究食管癌（esophageal carcinoma，EC）患者血清的代謝組特征，找出與癌變有關的標志性代謝物。

1 儀器與試藥

于南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院收集健康人血清10例和食管癌患者血清 20例（2008年 8月～2009年 2月），取 400 μl上層血清加至5 mm NMR測試管中，后加入100 μl 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH=7.4）和 50 μl雙重水，振蕩混勻。

2 方法與結果

2.1 NMR實驗

利用BRUKER 500 MHz超導核磁共振波譜儀對每一個樣品采集 1D NOESYPR1D 和 CPMG（relaxation delay-90-（τ-180-τ）n-acquisition）氫譜。在 NOESYPR1D 實驗中，混合時間 tm為 100 ms，t1延遲為 3 μs。CPMG 回波實驗中，回波時間為100 ms，延遲時間3 s，64 k數(shù)據(jù)點，采集次數(shù)為128。化學位移定標為乳酸甲基雙重峰δ1.33。

2.2 數(shù)據(jù)預處理

對所有1HCPMG譜進行自動積分（TOPSPIN 2.0），積分區(qū)間δ0.5～9.0，積分間隔Δδ=0.02。為了消除壓水后殘余水峰的影響，δ4.6～5.2的積分值設為零。主成分分析前對每一個譜的積分值進行歸一化處理，后將歸一化值導入軟件Simca-P 10.0（Umetrics，Sweden）中進行主成分分析。

2.3 結果

2.3.1 不同脈沖序列1HNMR譜 對本文中每一個血清樣本均作了NOESYPR1D和CPMG譜（圖1）。在NOESYPR1D譜中，脂信號如 δ 0.89、1.3、1.59、2.02和 2.25比較明顯，且與其他小分子信號有重疊。在CPMG譜中，由于T2濾波，脂信號強度降低。由于CPMG抑制了脂類等大分子信號峰，突出了小分子代謝物，CPMG譜的基線較NOESYPR1D譜平滑，這也減小了譜峰重疊帶來的分析誤差。

2.3.2 PCA分析 圖2給出對健康人（○）和食管癌患者（■）血清1HCPMG 譜的主成分分析結果（PC1vs PC2，R2＝78.4%），分析結果以得分圖（score plot）和負載圖（loading plot）給出。通過圖2（a）可以看到，健康人和食管癌患者血清樣本在PC1維可以區(qū)分開。圖2（b）給出了兩類樣本中主要的代謝物變化，可以看到食管癌患者血清中脂和乳酸的含量是升高的，而膽堿和葡萄糖是降低的。

3 討論

代謝組學得到的是大量、多維的信息，需要應用一系列化學計量學方法進行數(shù)據(jù)分析才能充分挖掘所獲得的數(shù)據(jù)中的潛在信息。主成分分析（PCA）是一種無監(jiān)督模式識別方法，可以直觀地在多維空間上描述樣品間的差異，它是一種在保持數(shù)據(jù)信息損失最少的原則下，對高維變量空間進行降維處理的線性映射方法，由于PCA分析操作的簡便和變量的可解釋性，它已經成為代謝組學研究的常用方法[5-6]。

原始NMR譜往往由于數(shù)據(jù)量過大、數(shù)據(jù)點的高度相關性以及溶劑峰、溶劑峰壓制后的殘余峰和基線等帶來的影響而不能直接拿來作模式識別分析，因此，通常需要對NMR譜進行預處理。此外，為了消除pH值等引起的化學位移的微小變化，還需要對NMR譜進行分段積分。積分區(qū)間一般為Δδ＝0.04或 Δδ＝0.02，在500MHz譜儀上對應于 20Hz或 10 Hz。這樣，積分區(qū)間的平均化學位移和積分強度組成了一個新的低分辨率NMR譜，用于模式識別分析。

通過1HCPMG譜可以明顯觀察到異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸鹽、丙酮酸、肌酸、膽堿、三甲胺、葡萄糖、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸等信號峰，且與NOESYPR1D1H譜比較，分辨率得到提高，譜峰重疊減小。所以為了重點研究小分子信號的代謝變化，主成分分析主要針對1HCPMG譜數(shù)據(jù)進行。通過PCA分析得到：食管癌患者血清中脂和乳酸的含量是升高的，而膽堿和葡萄糖是降低的。

乳酸含量升高和葡萄糖含量降低可能與血清中增強的無氧糖酵解過程有關。腫瘤細胞生長繁殖加快，需要更多的能量來維持，而快速生長和缺血壞死使癌細胞處于缺氧狀態(tài)，這就促進了葡萄糖的糖酵解過程，產生大量乳酸，造成癌細胞內的乳酸堆積[7]。因此，乳酸常被看成是腫瘤惡性程度的標志性代謝物。

總之，基于核磁共振和主成分分析的代謝組學方法能夠給出食管癌患者血清代謝差異，為食管癌診斷提供可靠的分子水平上的代謝證據(jù)。

[1]楊永霞,楊生義,梁敏鋒,等.基于核磁共振波譜的乙肝患者血清代謝組研究[J].第二軍醫(yī)大學學報,2010,31(3):288-291.

[2]高崗,楊根金,婁子洋.腎虛證大鼠尿液的核磁共振譜代謝組學研究[J].第二軍醫(yī)大學學報,2009,30(5):565-568.

[3]Lehnhardt FG,Bock C,Rohn G,et al.Metabolic differences between primary and recurrent human brain tumors:a1HNMR spectroscopic investigation[J].NMR Biomed,2005,18(6):371-382.

[4]Siedlecki W,Siedlecka K,Sklansky J.An overview of mapping techniques for ecploratory pattern analysis[J].J Pattern Recogn,1998,21(5):411-429.

[5]Waters NJ,Holmes E,Williams A,et al.NMR and pattern recognition studies on the time-related metabolic effects of 2-Naphthylisothiocyanate on liver,urine and plasma in the rat:an integrative metabonomic approach[J].Chem Res Toxicol,2001,14(10):1401-1412.

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