人牙齦成纖維細胞的原代培養及鑒定

崔 娟 ，孫克勤 ，李 霞 ，張華屏

（1.山西醫科大學口腔醫院口腔內科，山西太原 030001；2.山西醫科大學中心實驗室，山西太原 030001）

人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）是牙齦結締組織中的主體細胞，在牙周組織的保護和修復中起重要作用[1]。許多學者利用牙齦成纖維細胞體外培養模型，在牙周組織發病機制及治療方面進行了有益的探索[2]。原代培養是獲取牙齦成纖維細胞的主要手段，目前有酶消化法和組織塊培養法[3]。本實驗采用組織塊法培養人牙齦成纖維細胞，為進一步研究細胞因子對牙齦成纖維細胞的調控作用提供實驗條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM 培養液（Gibco，美國）；胎牛血清（四季青，杭州）；胰蛋白酶（Sigma，美國）；抗波形絲蛋白抗體、抗角蛋白抗體、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（中杉金橋，北京）；25 ml塑料培養瓶、六孔板（Orange scientific，比利時）；RCO3000-7 CO2培養箱（REVCO，美國）；GB-Ⅱ超凈工作臺（北京市新技術應用研究所）；倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織來源

牙齦組織取材于山西醫科大學口腔醫院口外科門診因正畸需拔牙或者因手術需切除牙齦且牙齦無炎癥的患者，征得其同意后切取牙齦組織，患者年齡12～26歲。

1.2.2 組織塊法培養及傳代

新鮮切取的牙齦組織立即投入預冷含雙抗的DMEM培養液中（含青霉素 100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml），在超凈工作臺中用5倍抗生素溶液浸泡消毒，在無菌培養皿中用眼科剪將牙齦組織剪成1 mm3大小（剪切時在組織塊上滴加DMEM培養液，且盡量去除上皮組織），用牙科探針將組織塊以均勻間距分散接種于25 ml培養瓶壁上，倒置培養瓶在CO2培養箱中（5%CO2，95%空氣，100%濕度，37℃恒溫）孵育 4 h 后翻瓶，加入DMEM培養液。當細胞長至培養瓶底80%左右時，用0.25%胰酶消化，以 1∶2 或 1∶3傳代。

1.2.3 細胞的鑒定

1.2.3.1 形態學鑒定 倒置顯微鏡下觀察細胞由組織塊邊緣游出的情況，觀察細胞形態及傳代后細胞生長狀況。

1.2.3.2 免疫學鑒定 細胞傳至4代，制成1×105/cm2的細胞懸液，制備細胞爬片，按免疫組化試劑盒說明書及DAB顯色步驟，分別進行抗波形絲蛋白抗體、抗角蛋白抗體染色，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替抗體作為陰性對照組，光鏡下觀察染色結果。

1.2.4 細胞生長曲線

取4代生長狀態良好的牙齦成纖維細胞，0.25%胰酶消化后，加入DMEM培養液離心，將細胞稀釋為1×104～2×104/cm2，接種于 96 孔板中，200 μl/孔，每 24 小時測定一板，每孔加入 20 μl MTT 培養 4 h。吸出上清加入150 μl/孔 DMSO，室溫下振蕩10 min；490 nm處測定吸光度，繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 細胞原代培養成功率

本實驗共接種10例牙齦組織，其中8例組織塊周圍有細胞游出，游出時間為10～15 d，接種的10例組織無一例污染，6例在細胞游出30 d左右長滿瓶底并傳代成功，其他2例未在30 d內長滿瓶底且細胞有老化趨勢，被淘汰，細胞培養成功率為60%。

2.2 細胞傳代

細胞單層長滿瓶底80%可進行傳代，用0.25%胰蛋白酶消化，不同形態的細胞對胰酶敏感性不同，成纖維樣細胞幾分鐘內即被胰酶從瓶壁上消化下來，以此可分離成纖維細胞和上皮源性細胞，傳代后貼壁良好，形態不發生改變，生長速度加快，細胞長滿單層，呈漩渦狀、柵欄狀、放射狀排列。

2.3 細胞鑒定

2.3.1 形態學鑒定

倒置顯微鏡下，原代及傳代生長的細胞呈長梭形或星形，核呈圓形或橢圓形，有數目不等、長短不同的胞質突，核仁清晰可見，呈典型的成纖維樣細胞形態。原代培養的細胞以組織塊為中心呈放射狀生長，傳代后的細胞呈放射狀或漩渦狀走行，排列緊密，有極性。

2.3.2 免疫學鑒定

光鏡下對細胞進行免疫組化染色觀察，顯示細胞抗波形絲蛋白染色陽性，胞質內陽性顆粒均勻分布，胞核清晰、無染色；抗角蛋白染色陰性，證明細胞為中胚層來源，且無上皮源性細胞混雜。陰性對照組均未見陽性染色結果。

2.4 細胞生長曲線 見圖1。

圖1 HGFs的生長曲線

3 討論

牙周病是發生在牙齒支持組織（包括牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質）的慢性非特異性感染性疾病，是導致成年人失牙的主要原因[4]。隨著老齡化社會的到來，牙周病尤其牙周炎更將成為突出的保健問題，是學者研究的熱點和難點。廣義上牙周病包括牙齦炎和牙周炎。牙齦炎是牙周炎的前驅和首要癥狀，防治牙齦炎可有效防止牙周炎的發生及發展。牙齦成纖維細胞是牙齦結締組織中的主體細胞，不僅具有活躍的自身更新能力，而且可合成膠原纖維、彈性纖維及基質[5]。已有報道牙齦成纖維細胞具有一定的潛在成骨能力，使牙齦成纖維細胞有望成為牙周組織工程的種子細胞[6-7]。此外，牙齦成纖維細胞的體外培養成活率高于牙周膜成纖維細胞，取材方便，創傷較小。因此，體外建立牙齦成纖維細胞模型有利于今后對牙周組織炎癥機制和防治措施的進一步研究。

細胞原代培養目前有酶消化法和組織塊培養法，本實驗利用組織塊法，操作簡便，污染率低，創傷小，成活率較高，進一步證實組織塊法是培養牙齦成纖維細胞的經典方法。通過形態學和免疫學鑒定，細胞呈長梭形或星形，抗波形絲蛋白抗體陽性，抗角蛋白抗體陰性，證明是中胚層非上皮來源細胞，結合組織取材部位，證實本實驗培養的是人牙齦成纖維細胞。在傳代培養過程中，由于操作和條件的限制，有時不能完全去除上皮組織而混有上皮源性細胞，但兩種細胞對胰酶的敏感性不同，消化時間長短不同，因此可通過傳代純化成纖維細胞[3]。

細胞培養是進行多種實驗研究的基礎，組織中分離的原代細胞與體內細胞性狀相似，較好地保存了細胞的遺傳特征和生物學特性[8]，又避免了體內研究所受的多因素干擾，使實驗結果更為可靠。但是體外培養的細胞反復傳代性狀有可能發生改變。因此，體外培養的細胞要在穩定的狀態下方可進行實驗。本實驗通過對細胞的形態學觀察及對繪制的細胞生長曲線進行分析顯示，3～6代牙齦成纖維細胞形態結構穩定，生長狀態良好，適于進行實驗研究；8代以后細胞生長時間延長，細胞形態改變，有融合老化趨勢，不再適合進行實驗研究。

細胞培養的成功與否受到很多因素的影響，①新鮮組織的消毒：盡量避免組織過多在外暴露及與其他有菌物品接觸，實驗中應用一定濃度的抗生素既防止污染又不影響細胞的生長；②減少影響接種時細胞貼壁的不利因素：接種4 h內應盡量不移動培養瓶，而且接種時組織塊的濕潤程度要適中；③培養液胎牛血清的濃度：細胞從組織塊游出過程中，培養液中胎牛血清的濃度高，更利于細胞生長；④無菌觀念：操作的全部過程都要謹慎保持無菌觀念，使細胞生長良好。

[1]Bartold PM,Walsh LJ,Narayanan AS,et al.Molecular and cell biology of the gingival[J].Periodontology,2000,24(1):28-55.

[2]劉斌,吳軍正.人牙齦成纖維細胞系的建立及生物學特性[J].牙體牙髓牙周病學雜志,1999,9(1):34-36.

[3]司徒振強,吳軍正.細胞培養[M].西安:世界圖書出版社,1996:65,71.

[4]Okuda K,Kato T,Ishihara K.Involvement of periodontopathic biofilm in vascular diseases[J].Oral Diseases,2004,10(1):5-12.

[5]Hoang AM,Chen D,Oates TW,et al.Development and characterization of a transformed human periodontal ligament cell line[J].Periodontol,1997,68(11):1054.

[6]王琨,許彥枝.人牙周膜細胞和人牙齦成纖維細胞生物學活性的研究[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2008,18(6):3-5.

[7]許彥枝,王坤.骨碎補對人牙齦成纖維細胞超微結構和堿性磷酸酶活性的影響[J].中國實用口腔科雜志,2008,1(3):157-160.

[8]任娟,李霞,孫克勤,等.人牙周膜成纖維細胞的原代培養和鑒定[J].中國藥物與臨床,2007,7(9):672-673.