骨髓間充質干細胞對大鼠實驗性肺氣腫的作用

李 旭，李寶平

（山西醫科大學，山西太原 030001）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是呼吸系統疾病中的常見病和多發病，此病患病率和死亡率均高，可導致患者肺功能進行性減退，嚴重影響其勞動力和生活質量，因此成為一個重要的公共衛生問題。COPD與慢性支氣管炎和肺氣腫密切相關，而肺氣腫是指肺部終末細支氣管遠端氣腔出現異常持久的擴張，并伴有肺泡壁和細支氣管破壞而無明顯的纖維化[1]。因此，對肺氣腫的治療在COPD的治療中顯得尤為重要。目前研究認為肺氣腫是一種不可逆轉的病理改變[2-4]，對此病尚無有效的根治方法。骨髓間充質干細胞（MSCs）是成體干細胞的一種，是一類多能干細胞，具有多向分化的潛能[5-6]，其多向分化的特性為我們治療不可逆病變提供了一種新的思路。本實驗在用煙熏誘導大鼠肺氣腫形成后，觀察使用MSCs后的干預作用，為肺氣腫的治療提供參考和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar雌性大鼠 24 只，鼠齡 8 周，體重（180±20）g；Wistar雌鼠1只，鼠齡6周，體重約150 g（山西醫科大學生理實驗動物中心提供）；4,6-二乙酰基-2-苯基吲哚（DAPI，北京中杉金橋生物技術有限公司）；Anti-Pan-cytokeratin（北京博奧森生物技術有限公司）；羊抗兔IgG-Cy3（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 Wistar雌性大鼠24只隨機分為四組，每組6只，分別為健康組（A組）、模型組（B組）、生理鹽水對照組（C組）和治療組（D組）。B、C、D組均利用煙熏的方法誘導其肺氣腫的形成，之后D組給予骨髓間充質干細胞治療，C組給予生理鹽水作為對照，給藥4周后處死大鼠。

1.2.2 大鼠肺氣腫模型的制作 參照許三林等的方法自制大鼠實驗性被動吸煙裝置，將大鼠置于自制玻璃箱內被動吸煙，每次點燃香煙（金絲猴牌，寶雞卷煙廠制）10支，1次/d，持續30 min，每周6次，連續12周，12周后肺氣腫形成。

1.2.3 大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養 取6周齡Wistar雌鼠1只，采用無菌操作的方法，用咬骨鉗將股骨和脛骨兩骨端剪去，用PBS緩沖液將骨髓沖入離心管中，用吸管吹吸混勻。用比重為1.077 g/ml的淋巴細胞分離液進行分離，用含10%胎牛血清的DMEM培養液懸浮細胞，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育。待細胞生長密度達80%～90%時進行消化，以1∶2比例進行傳代，擴增培養[7]，通過多次傳代對細胞進行純化，取第3代細胞。

1.2.4 細胞標記 取第3代大鼠骨髓間充質干細胞，加入無菌的DAPI至終濃度為50 g/L，在37℃條件下孵育30 min，離心后PBS反復洗滌以去除未結合的DAPI，離心收集細胞，稀釋至1×1010/L，放于冰浴中，1 h內將細胞通過尾靜脈注射注入受體大鼠體內。

1.2.5 肺組織病理標本的制備 斷頸處死大鼠后，在胸部切斷肋骨，以暴露氣管、肺臟等，主支氣管切斷后用彎鉗將其提起，沿背部脊柱前方分離，將肺臟及心臟分離出來，剪去心臟后在25 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）壓力下經氣管灌注10%中性甲醛溶液固定肺臟30 min，結扎氣管，浸入10%中性甲醛溶液，固定48 h，每只大鼠各取雙側最大橫徑處肺組織，常規石蠟包埋切片，HE染色。

1.2.6 Pan-cytokeratin免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟后，將切片放入蒸餾水中，PBS洗3次，5 min/次，0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）微波抗原修復，滴加5%BSA封閉液，加入 Anti-Pan-cytokeratin（稀釋比 1∶200，抗體稀釋液為 0.3%Triton X-100/PBS），4℃過夜，陰性對照組用PBS代替。加入羊抗兔 IgG-Cy3（稀釋比 1∶50）1∶100 稀釋，50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察熒光染色的結果并拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠肺臟大體標本觀察

健康組肺臟表面平整光滑，淡粉紅色，質地較軟，彈性較好，指壓后無壓痕。模型組肺臟體積明顯增大，彈性較差，呈蒼白色，經指壓后可留有壓痕，肺臟切面可見多量較大的肺泡腔，呈現不規則的形狀，且大小不一。D組和C組肺臟病變較B組輕。

2.2 肺組織病理學觀察

在顯微鏡下觀察HE染色后的病理切片。A組大鼠肺組織肺泡大小均勻，肺泡數目較多，肺泡間隔較厚。B組出現肺內呼吸性細支氣管、肺泡管、肺泡等的擴大，肺泡大小不一，肺泡數目明顯減少，肺泡間隔變窄，并有不同程度的斷裂。C組大鼠肺組織病理切片HE染色鏡下觀察，肺組織病理變化與B組相似，無明顯變化。D組大鼠肺組織病理切片HE染色鏡下觀察，肺泡數目較C組增多，肺泡面積減小，肺泡間隔增厚。

2.3 大鼠平均肺泡數（MNa）和平均肺泡面積（MAA）

在100倍顯微鏡條件下，觀察四組大鼠的肺臟病理切片，每只大鼠觀察2張片子，每張片子隨機選擇10個視野進行肺泡計數，計數每個視野內的肺泡數（Na），測出每個視野的面積（TA），HE染色陽性區域為肺實質的面積（PA），以MAA=（TA-PA）/Na計算每個視野的平均肺泡面積，測量時盡量避開支氣管及大、中血管。結果見表1。

表1 各組大鼠 MNa及MAA（）

表1 各組大鼠 MNa及MAA（）

與 D組比較，*P＜0.05

組別 大鼠只數 MNa（個） MAA（μm2）A組664±6*44080±5078 B組631±7*102573±22783*C組633±4*90645±21715*D組646±564421±5223

經方差分析，MNa四組總體上 F=11.164，P=0.001，MAA四組總體上F=8.603，P=0.002，說明四組總體上MNa與MAA均有顯著性差異。SNK-q檢驗兩兩比較結果顯示，D組單位面積 MNa明顯高于 B 組（P＜0.05）和 C 組（P＜0.05），但明顯低于 A 組（P＜0.05），B 組和 C 組之間無顯著性差異（P＞0.05）。四組 MAA 比較：A、D 組無顯著性差異（P＞0.05），B、C 組之間無顯著性差異（P＞0.05），D 組 MAA 明顯低于 B組（P＜0.05）和C組（P＜0.05）。結果表明，D組單位面積MNa明顯高于B組和C組，但仍低于A組；MAA明顯低于B組和C組。

2.4 注射的骨髓間充質干細胞的檢測

D組在熒光顯微鏡下，用DAPI標記后的骨髓間充質干細胞可以看見藍色的胞核，說明注射的骨髓間充質干細胞進入肺組織中。此外，在肺組織中做Pan-cytokeratin免疫熒光染色，可見D組大鼠肺組織的肺泡壁、支氣管壁均有大量紅染的陽性細胞，還可發現少量胞核為藍色的細胞，同時胞質為紅色，提示供體來源的骨髓間充質干細胞在受體肺組織內可分化為上皮細胞。見圖1～3（圖1～3為同一視野，箭頭所指為同一細胞）。

圖1 可見大鼠肺組織內藍色的細胞核（DAPI標記）（×200）

圖2 免疫熒光染色可見肺泡上皮細胞呈紅色（Cy3標記）（×200）

圖3 在大鼠肺組織內可見同時具有藍色胞核和紅色胞質的細胞（×200）

3 結論

肺氣腫在臨床上表現為進行性發展的不可逆的氣流受限，在病理學上表現為肺部終末細支氣管遠端氣腔出現異常持久的擴張，并伴有肺泡壁和細支氣管的破壞而無明顯纖維化的疾病，具有極高的死亡率和致殘率[8]。肺氣腫的內科治療以預防感染、控制并發癥同時配合呼吸運動鍛煉來改善患者的呼吸功能，雖有一定的作用，但不能阻止病情發展。外科方面，肺移植術和肺減容術已成為治療終末期肺氣腫最有效的方法[9-11]，對于終末期肺氣腫而言，唯一有效的治療方法就是實行肺移植，但肺移植技術也有很大的局限性，如供體缺乏、價格昂貴等，所以無法廣泛應用。本實驗應用骨髓間充質干細胞為研究對象，就是因為間充質干細胞是一類具有分化潛能的細胞，可以在特定條件下分化為多種細胞，它的損傷趨化性可以使骨髓間充質干細胞“游”向損傷部位，并在局部微環境條件下誘導分化修復損傷部位。

制作肺氣腫模型的方法多種多樣，使用比較多的是彈性蛋白酶和香煙煙霧刺激的方法，使用彈性蛋白酶制作肺氣腫模型雖然周期短，但是由于液態的彈性蛋白酶混合液要在氣管內彌散，通過大鼠的呼吸來進行分布，所以不能均勻分布，以致肺氣腫的病變以及病變程度的分布都是不均勻的，與此相比，香煙煙霧的刺激能更好地模擬人類肺氣腫的發病情況[12]。因此，本實驗采用煙熏來誘導大鼠肺氣腫的形成。

本實驗在對四組病理切片進行分析后，可以看到經過骨髓間充質干細胞治療的大鼠單位面積MNa明顯高于B組和C組，MAA明顯小于B組和C組，說明肺氣腫的病理變化發生了改善，同時在熒光顯微鏡下我們看到DAPI標記后的骨髓間充質干細胞進入了受損的肺組織，還發現其分化為上皮細胞，這些都說明骨髓間充質干細胞參與了肺組織的再生。骨髓間充質干細胞在此過程中發揮了重要的作用，這就為治療肺氣腫提供了一條新思路。本實驗只是一個初步的研究，骨髓間充質干細胞在這個過程中是否有其他作用，以及其分化的機制是什么，肺氣腫的病理變化是否能得到逆轉，都還需要進一步研究。

[1]中華醫學會呼吸病學會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007年修訂版）[J].中華結核和呼吸雜志,2007,30(1):8-17.

[2]Thomas L,Petty M.COPD in perspective[J].Chest,2002,121(5):116S-120S.

[3]Stephen I,Rennard D.New understanding of pathogenesis and mechanisms can guide future therapy[J].Postgraduate Medicine Minneapolis,2002,6(111):28-32.

[4]Angela B,Mark E,Melinda A.Chronic obstructive pulmonary disease:assessing and treating psychological issues in patients with COPD[J].Geriatrics,2005,12(60):18-21.

[5]Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhardt RL,et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J].Nature,2002,418(6893):41-56.

[6]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilinegae potential of adult human mesenchymal stem cell[J].Science,1999,284(5411):143-147.

[7]華平,熊利華,張華,等.骨髓間充質干細胞移植重建大鼠缺血心肌的實驗研究[J].中華顯微外科雜志,2004,2(27):117-120.

[8]Pauwels RA.Global strategy for the diagnosis,management,and prevention of chronic obstructive pulmonary disease.NHLIB/WHO global initiative for chronic obstructive lung disease(GOLD)workshop summary[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,163(5):1256.

[9]National Emphysema Treatment Trial Research Group.A randomized trial comparing lung-volume-reduction surgery with medical therapy for severe emphysema[J].N Engl J Med,2003,348(21):2059-2073.

[10]Cooper JD. The history of surgical procedures for emphysema [J].AnnThorac Surg,1997,63(2):312-319.

[11]Meyers BF,Patterson GA.Chronic obstructive pulmonary disease.10:bullectomy,lung volume reduction surgery,and transplantation for patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Thorax,2003,58(7):634-638.

[12]Shapiro SD.Animal models for COPD[J].Chest,2000,117(Suppl 1):223S-227S.