單雙波長在生物活性測定中的比較研究

趙 鴻

（北京雙鷺藥業股份有限公司，北京 100041）

生物制品活性測定實驗大多用MTT法，使用酶標儀掃描比色，通過數據分析得出實驗結果。一般酶標儀有單波長和雙波長兩種測定模式[1-2]，而且采用的都是垂直光路。選擇單波長測定就是選擇測定波長[3]，直接測定樣本的吸光度。而雙波長測定時采用不同的波長，即測定波長（主波長）和參比波長（次波長）同時測定樣品的吸光度，以清除一些外在影響因素，提高測定結果的精密度和準確度。但鑒于日常工作關于單雙波長對于實驗結果的影響程度不是很了解，因此想通過此次比較實驗了解單雙波長對生物活性測定實驗結果影響的大小以及單雙波長哪個更適合于生物活性測定實驗。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Emax酶標儀（美國分子儀器公司）；單道移液器[1ml（Gilson）、200 μl（Gilson）、20 μl（Gilson）]；8 道移液器（Finnpipette）。

1.2 試藥

本公司生產的 IL-11 成品（批號：20080801，600 U IU/支）；IL-11 原液（批號：20080804，4.563 mg/ml）。

2 方法與結果

2.1 MTT比色法

B9-11細胞常規培養，實驗時離心收集對數生長期的細胞，以10%新生牛血清的RPMI 1640培養基調整細胞數為2×105個/ml，每孔加入 50 μl細胞懸液，再加入 50 μl待測的樣品（空白對照孔加 50 μl培養基），在 37℃、5%CO2條件下培養 72 h后，每孔加入 5 mg/ml的 MTT溶液 10 μl，繼續培養4 h，而后加入MDF裂解液100 μl，37℃孵育過夜，酶標儀掃描570 nm或570 nm+630 nm測定OD值，使用軟件SOFTmaxPRO 3.1分析得出實驗結果。

2.2 單雙波長測定結果比較

本公司生產的 IL-11成品（批號：20080801，600 U IU/支）和 IL-11 原液（批號：20080804，4.563 mg/ml）的單波長 570 nm和雙波長570 nm+630 nm測定結果的比較[1]，見表1、2。

由表1、2可知，成品和原液相應的單波長和雙波長測定結果相接近，單波長測定結果的標準方差和CV（%）明顯高于雙波長。

表1 IL-11成品兩種測定方法的測定結果Tab.1 Resluts of two detecting methods of finished product IL-11

表2 IL-11原液兩種測定方法的測定結果Tab.2 Resluts of two detecting methods of original liquid IL-11

2.3 IL-11成品單雙波長各掃描兩次測定結果的穩定性比較[4] 見表3。

表3 IL-11成品單雙波長兩次測定結果Tab.3 Resluts of Dual-wavelength method of finished product IL-11

由表3可知，單波長兩次測定結果比雙波長兩次測定結果差異大，雙波長測定兩次的結果重復性好于單波長。

2.4 IL-11成品單雙波長測定結果相對偏差的比較 見表4。

表4 IL-11成品兩種測定方法的測定結果相對偏差Tab.4 RSD of two kinds of detecting methods of finished product IL-11

由表4可知，單波長測定方法的相對偏差明顯高于雙波長測定。

2.5 IL-11樣品生物活性測定細胞空白吸光度的比較 見表5。

表5 IL-11樣品生物活性測定細胞空白對照孔吸光度OD值Tab.5 Blank absorbance on bioactivity detection of sample IL-11

由表5可知，雙波長可以排除一部分劃痕和洗滌劑對實驗的可能干擾，其吸光度OD值明顯小于單波長。

為了降低檢驗成本，生物活性測定實驗所使用96孔細胞培養板均非一次性使用，不可避免的存在劃痕和洗滌劑等殘留物。

3 討論

單波長測定時通過對顯色具有最大吸收的波長如570 nm進行吸光度測定[1]，而雙波長測定則是酶標儀在敏感波長如570 nm和非敏感波長630 nm下各測定1次，敏感波長下的吸光度為特異性顯色的吸光度與板底被贓物（包括劃痕）污染后的吸光度之和，非敏感波長下測定的是改變波長到一定值，使特異顯色的吸光值為零，此時測得的吸光度即為贓物的吸光度，最后酶標儀給出的數值為敏感波長吸光度值與非敏感波長的吸光度值的差。

酶標儀采用垂直光路，特點是樣品吸光度受液體濃縮或稀釋的影響小，但受被測樣品液面是否水平、細胞板的透光性、孔底是否平整等因素的影響較大。 因此孔與孔之間存在一定的差異。

酶標儀在用單波長測定時，除受到測定的干擾和電路干擾等因素外，受液體表面張力的影響也很大。由于表面張力的作用，液體的表面不是一個平面，而是形成一個凹液面，光線通過液體時，除被液體吸收一部分，還有一部分被折射和反射，影響吸光度的檢測，且使用的洗滌劑均含有表面活性劑，這樣液面會更凹，對單波長的影響更大。雙波長的測定時采用兩個不同波長（測定波長和參比波長）同時測定一個樣品的吸光度，它們的差值是樣品相對準確的吸光度，這樣就會減少了測定干擾和電路干擾。

雙波長差吸光度法具有可以克服一些外界環境的影響[5-6]，共存組分吸收譜疊加的干擾，以及減少比色的光學不均一性等特點，吸光度在一定的范圍內有良好的線性關系。

因此，雙波長測定明顯比單波長更適合于生物活性測定實驗，其可以提高實驗結果分析的準確度，減少實驗誤差。

[1]邱娜.酶標儀單、雙波長檢測的比較[J].臨床輸血與檢驗,2007,9(1):61.

[2]李正勇.酶標儀單波長和雙波長檢測技術分析[J].現代醫藥衛生,2005,21(1):24.

[3]梁雙吟,李小云,莊祥龍.酶標儀單波長和雙波長的比較[J].海南醫學,2006,17(3):113.

[4]阮艷秋,陳志遠.酶標儀雙波長和單波長檢測技術分析[J].西部醫學,2008,20(1):180-183.

[5]林開生,鄧勉君.酶標儀雙波長和單波長選擇的測試對比[J].國際醫藥衛生導報,2004,10(12):150.

[6]李雪志.雙波長差吸光度法及后分光技術的應用和發展前景[J].實用醫學檢驗雜志,1996,3(1):58.