CXCR-4/SDF-1軸在BMSCs向新生小鼠缺氧缺血腦組織定向遷移的潛在機制研究

申明琪 初桂蘭*

新生兒缺氧缺血性腦病（Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是圍生期窒息中常見的中樞神經系統疾病，常造成彌漫性、進行性的神經細胞壞死和凋亡，導致患兒死亡或遺留永久性神經系統后遺癥[1]。目前仍缺乏有效的針對性治療手段，而以支持治療為主的綜合療法往往效果欠佳。骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潛能，在一定條件下能夠誘導分化為神經細胞，發揮神經細胞替代和組織修復功能，為HIBD的治療帶來了曙光[2]。但在其臨床應用前仍存在較多問題，如BMSCs定向誘導分化的調控機制、定向遷移機制等[3,4]。本研究著重觀察BMSCs是否存在向HIBD腦組織的定向遷移能力，并初步分析CXCR-4/SDF-1軸在細胞定向遷移過程中可能發揮的作用機制，為臨床應用BMSCs治療HIBD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與動物

胎牛血清（杭州四季青），DMEM培養基、胰蛋白酶（Corning公司）；FITC標記抗體CD29、CD34、CD71和CD105（Serotec公司），兔抗大鼠CXCR-4抗體（北京中杉公司），ELISA試劑盒（武漢博士德公司）；清潔級7日齡SD大鼠幼鼠20只，隨機分為正常對照組和HIBD組，每組10只，以及2周齡SD大鼠幼鼠4只，由天津市放射研究所動物中心提供，動物合格證號：SCXK（津）2005-0001。

1.2 BMSCs培養與鑒定

2周齡大鼠幼鼠頸部脫臼處死，75%酒精浸泡15min，無菌條件下分離雙側股骨，剪開干骺端，用1mL注射器抽取DMEM完全培養液反復沖洗骨髓腔，制成單細胞懸液，移入25mL塑料培養瓶中，37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養，48h后首次半量換液，此后每3d全量換液，3～4次傳代后逐漸去除混雜細胞，得到純化BMSCs后可用于后續試驗研究。取生長狀態良好的第4代BMSCs，充分懸浮后制成單細胞懸液，FITC標記CD29、CD34、CD71、CD105抗體室溫避光染色30min，流式細胞儀和CELLQuest軟件采樣分析實驗結果。

1.3 HIBD模型的制備

HIBD組大鼠按RICE法[5]制作HIBD模型。正常對照組只分離頸總動脈，不結扎，也不予缺氧。

1.4 腦組織勻漿上清液制備

造模后24h冰凍麻醉后處死各組大鼠，無菌條件下取出左右大腦，置冰上，迅速稱重，加入DMEM培養基，勻漿，4℃以12 000r /min，離心15min，收集上清。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

分正常腦組織對照組和HIBD裂解液組。胰酶消化后收集細胞懸液，取約1×104個BMSCs種植于Transwell上室，下室為對照組和HIBD裂解液組腦組織勻漿上清液，48h后取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，蘇木素染色，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下觀察。

1.6 ELISA方法檢測上清液中SDF-1表達

加0.1mL待檢樣品于反應孔中，置37℃孵育1h后洗滌，于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體0.1mL，37℃孵育0.5h，洗滌，加入臨時配制的TMB底物溶液0.1mL，37℃10min，加入2mol/L硫酸0.05mL。在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

1.7 細胞免疫組化方法檢測BMSCs中CXCR-4的表達

4%多聚甲醛固定，Triton X-100處理后，PBS平衡，山羊血清封閉30min；甩去血清，滴加1∶200稀釋的抗體工作液，濕盒中4℃過夜；加入FITC熒光標記二抗，hoechst33258復染，PBS和去離子水漂洗后，封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.8 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行方差分析和組間比較，P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs原代培養與鑒定

原代貼壁細胞成分復雜，隨著傳代次數增加，異種細胞逐漸被淘汰，于第4代可獲得形態均一的純化BMSCs，細胞呈長梭形或紡錘形，漩渦狀排列（圖1）；流式細胞儀檢測結果顯示BMSCs陽性標志蛋白CD29、CD71和CD105表達率分別為98.14%、99.12%和98.77%，陰性標志蛋白CD34表達率為1.19%，符合BMSCs特征。

圖1 第4代大鼠BMSCs形態較均一，呈長梭形或紡錘形，漩渦狀排列（A×400，B×200）

2.2 Transwell實驗檢測結果

當下室為對照組即正常腦組織勻漿上清液時，上室培養的BMSCs僅表現出較低的細胞遷移能力，細胞遷移率為（4.71±0.51）%；但當下室為HIBD裂解液時，上室培養的BMSCs表現出較對照組明顯增強的細胞遷移能力，細胞遷移率為（35.74±3.73）%（P＜0.05）（圖2）。

圖2 棉簽擦拭以后Transwell小室底面所見（×200）

2.3 ELISA檢測結果

正常腦組織勻漿液中SDF-1含量較低，為（11.25±2.11）ng/mL，而HIBD裂解液中SDF-1的含量為（43.24±4.17）ng/mL，兩組間比較有統計學差異（P＜0.01），見圖3。

2.4 CXCR-4的表達

胞質棕黃色示為CXCR-4表達陽性。當BMSCs浸潤在正常腦組織勻漿液中時僅見極低程度的CXCR-4表達，但當其浸潤在HIBD裂解液中時CXCR-4表達水平明顯提高，兩組間比較有統計學差異（P＜0.05），見圖4。

3 討 論

圖3 ELISA檢測SDF-1表達水平

圖4 免疫細胞化學方法檢測CXCR-4在BMSCs中的表達

HIBD是圍生期嬰兒窒息常見的中樞神經系統疾病，缺氧缺血誘導的腦損傷致神經元彌漫性、進行性壞死和凋亡，重度者往往導致患兒死亡，即使存活仍可能遺留永久性神經系統后遺癥，如癲癇、腦癱、智力低下等。目前仍缺乏有效的針對性治療手段，主要采取以支持治療為主的綜合療法，但效果往往欠佳。近年來干細胞在中樞神經系統疾病中的應用越來越多，如神經退行性疾病、腦創傷等。最初這方面的研究多局限于神經干細胞，但由于體內神經干細胞數量有限，不易于原代分離培養和長期體外擴增。BMSCs是存在于骨髓中明顯區別于造血干細胞的一類前體細胞，它具備明顯的自我復制更新和多分化潛能，且因其在體外容易獲得和擴增，相較于胚胎干細胞、臍血干細胞，倫理學限制較少，易于實驗室工作的大范圍展開。近年來圍繞BMSCs的研究越來越多，但將其應用于HIBD的移植治療性研究并不多見。本文就此展開初步研究。

作為一種來源于中胚層的成體干細胞，BMSCs具有向損傷組織、缺血區域定向遷移的能力，稱之為“歸巢”（homing），這種“歸巢”特性是體內干細胞修復損傷或替代壞死結構的基礎。目前關于干細胞的趨向性機制還不是很清楚，研究主要著眼于組織間各種生長因子或趨化因子[6]。Son等[7]在研究中發現，當周圍環境中的SDF-1和肝細胞生長因子升高時，干細胞表面CXCR4的受體數量明顯增加，且具有劑量依賴性。趨化因子在其他類型的干細胞遷移中作用的研究已有報道，例如CXCL-12及其受體CXCR-4 在骨髓的記憶、遷移、歸巢造血干細胞中起重要作用[8]。體外條件下趨化因子CXCL-8可趨化BMSCs遷移，封閉趨化因子受體CXCR-1后，其趨化遷移作用明顯減弱[9]。程鵬等[10]通過Transwell體系證實干細胞因子可以趨化BMSCs 發生定向遷移，這一遷移過程的細胞內信號轉導與p38MAPK通路有關。

本研究采用Transwell體外遷移模型證實BMSCs具有向缺氧缺血性腦組織定向遷移的能力，且向HIBD腦組織遷移能力高于正常腦組織裂解液（P＜0.01）。考慮可能因為腦缺氧缺血后分泌的誘導因子的種類和多少以及BMSCs表面受體與不同趨化因子作用的強弱等諸多因素有關。在接下來BMSCs向HIBD腦組織裂解液定向遷移可能存在的機制中我們發現，正常腦組織勻漿液中SDF-1含量較低，而HIBD裂解液中SDF-1的含量則明顯高于對照組，兩組間比較有統計學差異（P＜0.01）；同時當BMSCs浸潤在正常腦組織勻漿液中時僅見極低程度的CXCR-4表達，但當其浸潤在HIBD裂解液中時CXCR-4表達水平明顯提高，兩組間比較有統計學差異（P＜0.05）。

上述研究結果提示，CXCR-4/SDF-1軸在BMSCs向HIBD損傷腦組織定向遷移過程中可能扮演了重要角色。考慮在機體內復雜的病生理作用環境中常存在其他多個相互作用因子和元件，因此有關于BMSCs向HIBD損傷腦組織定向遷移的具體機制有待于進一步拓展和深入。

[1]Abend NS,Licht DJ. Predicting outcome in children with hypoxic ischemic encephalopathy[J].Pediatr Crit Care Med,2008,9(1):32.

[2]徐如祥.中樞神經系統損傷后神經再生的策略[J].中華神經醫學雜志,2007,6 (2):109-112.

[3]Deng J,Petersen BE,Steindler DA,et al.Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture and are neurogenic after transplantation[J].Stem Cells, 2006,24(4):1054-1064.

[4]Mankani MH,Kuznetsov SA,Shannon B,et al. Canine cranial reconstruction using autologous bone marrow stromal cells [J].Am J Pathol,2006,168(2): 542.

[5]Rice JE,Vannucci RC,Brierley JB.The inf l uence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat [J].Ann Neurol,1981,9(2):131.

[6]Sch?nemeier B,Kolodziej A,Schulz S,et al. Regional and cellular localization of the CXCl12/SDF-1 chemokine receptor CXCR7 in the developing and adult rat brain[J]. J Comp Neurol,2008,510(2):207-220.

[7]Son BR,Marquez-Curtis LA,Kucia M,et al. Migration of bone marrow and cord blood mesenchymal stem cells in vitro is regulated by stromal-derived factor-1-CXCR4 and hepatocyte growth factorc-met axes and involves matrix metalloproteinases[J]. Stem Cells,2006,24(5):1254–1264.

[8]Levesque JP,Hendy J,Takamatsu Y,et al . Disruption of t he CXCR4/CXCL12 chemotactic interaction during hematopoietic stem cell mobilization induced by GCSF or cyclophosphamide[J]. J Clin Invest,2003,111 (2) :187.

[9]李興澤,孟慶海,金澎,等.趨化因子CXCL-8趨化骨髓間充質干細胞遷移的體外效應[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(10):1908.

[10]程鵬,高志強,劉云會,等.干細胞因子對骨髓間充質干細胞定向遷移的影響[J].中國現代醫學雜志,2009,19(2)224.