免疫抑制劑作為DNA疫苗佐劑的研究①

米簡潔 朱慶鴻 付紅燁 劉 越 趙 佳 康友敏

(中國農業大學生物學院農業生物技術國家重點實驗室,北京100193)

免疫抑制劑是對機體的免疫反應具有抑制作用的藥物,臨床上主要應用于自身免疫性疾病患者的治療,但這些免疫抑制劑在臨床應用中存在不同程度的毒副作用。新近的研究表明有些免疫抑制劑能夠在體外刺激天然T細胞轉化為具有抑制功能的Treg細胞[1,2]。

自身免疫性疾病(Autoimmune Disease,AD)是機體對自身抗原產生免疫反應,達到一定強度以致能破壞自身正常組織結構,并引起一定的臨床癥狀,如多發性硬化癥(Multiple Sclerosis,MS)、Ⅰ型糖尿病、類風濕關節炎等。研究表明調節性T細胞的數量減少或功能異常均可能導致自身免疫性疾病的發生[3-5]。由于迄今對該類疾病的病因認識不清,對其發病機制研究不透,目前對于自身免疫性疾病的預防和治療還沒有理想的方法和藥物。疫苗免疫包括DNA疫苗,已經被證實能夠產生長期有效的免疫反應,重要的是疫苗免疫能夠產生抗原特異性,并能夠形成免疫記憶[6-8]。因此,本研究將免疫抑制劑作為自身免疫性疾病自身抗原的DNA疫苗佐劑共同免疫實驗動物,以誘導產生抗原特異性的Treg細胞,并對其預防AD進行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物免疫 雌性C57BL/6小鼠(購于中國醫學科學院實驗動物研究所),6～8周齡,每組8只。MS的DNA疫苗(p2MOG35)為實驗室構建保存。每只小鼠肌肉注射 p2MOG35100μg,FK506(Astellas Ireland Co.,Ltd)、CsA(Novartis Pharma GmbH,Germany)或MMF(Roche Registration Ltd.U.K.)10 μg,免疫兩次,間隔 2周 。

1.2 細胞內染色 在第二次免疫后7天,取小鼠脾臟,制備成單細胞懸液,裂解紅細胞后,利用細胞胞內染色的方法,1×106細胞加入PMA 50μg/ml和離子霉素100 ng/ml,同時加入莫能霉素(Golgisop產品),于37℃、5%CO2孵箱培育 4小時,利用 4%的多聚甲醛固定,0.1%的皂素破膜后,加入熒光標記的抗小鼠CD4、CD25、Foxp3的單克隆抗體(購于ebioscience)進行染色,流式細胞儀進行檢測,CD4+CD25+Foxp3+的T細胞為 Treg細胞,CD4+CD25+Foxp3+T細胞占總CD4+T的比例即Treg細胞比例。同時取樣品利用抗小鼠CD11c和IL-10熒光標記單克隆抗體(購于ebioscience)進行染色,CD11c+IL-10+細胞即表達IL-10的DCs細胞,結果以CD11c+IL-10+細胞占CD11c+細胞的比例進行統計分析。

1.3 T細胞增殖 在第二次免疫后7天,取各組小鼠脾臟,制備成單細胞懸液,裂解紅細胞后進行細胞計數,利用R&D系統分離純化CD4+T細胞加入96孔平底細胞板(Costar產品),每孔加入1×105～2×105個細胞,利用德國美天旎CD11c純化試劑盒分離純化naive小鼠的CD11c+細胞作為抗原遞呈細胞(APC),每孔加入1×104～2×104個細胞,分別加入MOG35～55多肽作為抗原刺激(終濃度5μg/ml),同時加入ConA(陽性對照,終濃度5μg/ml),BSA(非特異性抗原,終濃度5μg/ml)作為陽性和無關抗原對照,刺激 72小時后,每孔加入20μl MTT溶液顯色,37℃,5%CO2,培養3～4小時后,用酶標儀測定490 nm的OD值進行讀數,結果以刺激指數(SI)計算,公式為:SI=(各刺激孔OD值-培養基OD值)/(未刺激孔OD值-培養基OD值)。

1.4 EAE實驗動物模型 將完全弗氏佐劑(CFA,Sigma)與MOG35～55多肽充分乳化后,皮下多點注射雌性C57BL/6小鼠,每只小鼠注射 100μl(200μg MOG35～55多肽與50 μl CFA),同時向腹腔注射百日咳毒素(每只小鼠200 ng,Sigma),24小時候后再次腹腔注射百日咳毒素,以誘導小鼠發病。對誘導后的小鼠每天進行臨床打分,評分標準如下:0分,不發病;1分,尾部張力降低;2分,尾部無張力或后肢中度無力;3分,雙側后肢麻痹;4分,后肢麻痹伴前肢力弱或麻痹;5分,瀕臨死亡或死亡。

1.5 統計學處理 實驗結果用t檢驗進統計學分析,P＜0.05差異顯著,P＜0.01差異極顯著。

2 結果

2.1 不同免疫抑制劑對Treg細胞比例的影響 利用CsA、FK506或MMF作為佐劑與p2MOG35共同免疫小鼠兩次,間隔2周。第二次免疫后7天,取脾臟單細胞進行細胞內抗體染色,利用流式細胞儀檢測Treg細胞的比例,結果如圖 1所示,FK506與p2MOG35共同免疫組Treg細胞的比例最高為15%,顯著高于p2MOG35單獨免疫組(P＜0.05),CsA或MMF作為佐劑與p2MOG35共同免疫組與對照組相比,沒有顯著差異,表明FK506作為p2MOG35的佐劑能夠誘導Treg細胞的產生,使Treg細胞的比例顯著升高。

2.2 不同免疫抑制劑對T細胞增殖的影響 利用CsA、FK506或MMF作為佐劑與p2MOG35共同免疫小鼠兩次,間隔2周。第二次免疫后7天,取脾臟單細胞進行T細胞增殖試驗,結果如圖2所示。小鼠免疫FK506/p2MOG35組的SI與p2MOG35組相比顯著降低(P＜0.05)。CsA或MMF作為佐劑與p2MOG35共同免疫組的SI與對照組相比,沒有顯著差異,表明FK506作為p2MOG35的佐劑免疫小鼠后,能夠顯著抑制T細胞增殖反應。因此在后續試驗中,我們選用FK506作為p2MOG35抑制型的佐劑進行多發性硬化癥的預防。

圖1 不同免疫抑制劑對Treg細胞的影響Fig.1 The immunosuppressants effect on Treg

圖2 不同免疫抑制劑對T細胞增殖的影響Fig.2 The immunosuppressants effect on T cell proliferation

圖3 FK506作為佐劑對DC成熟的影響Fig.3 FK506 effect as adjuvant on DC maturation

2.3 FK506對DCs細胞的影響 DCs細胞接受抗原刺激后的成熟狀態,直接影響免疫應答的產生。第二次免疫后7天,取脾臟單細胞進行表面分子抗體染色,檢測DCs細胞的成熟狀態。結果如圖3所示,FK506與 p2MOG35共同免疫組成熟 DCs細胞(CD11c+CD80+)的比例顯著低于p2MOG35免疫組,表明FK506作為佐劑能夠抑制DCs細胞的成熟。利用流式細胞儀檢測DCs細胞表達IL-10的變化,結果如圖4所示,FK506與p2MOG35共同免疫組DCs細胞表達IL-10的比例最高為9.8%,顯著高于其他對照組,表明FK506作為佐劑能夠增強DCs細胞表達IL-10的能力。

2.4 FK506作為佐劑預防EAE的效果 利用FK506作為佐劑與p2MOG35共同免疫小鼠兩次,間隔2周。第二次免疫后7天誘導小鼠EAE模型,進行臨床打分,觀察小鼠EAE發病的變化。在發病高峰比較臨床打分結果如圖5所示。與p2MOG35免疫組相比,FK506與p2MOG35共同免疫組臨床打分顯著降低(P＜0.01),表明FK506作為佐劑能夠預防EAE的發病。

3 討論

圖4 FK506作為佐劑對DC細胞分泌IL-10的影響Fig.4 FK 506 effect as adjuvant on IL-10 expression in DC

圖5 FK506作為佐劑對EAE發病的影響Fig.5 FK506 effect as adjuvant on EAE

免疫抑制劑是能夠抑制機體免疫反應的藥物,主要應用于器官移植排斥反應、自身免疫病及過敏應的治療[9,10]。近年來研究發現有些免疫抑制劑反能夠影響Treg細胞的產生和功能[11,12]。DNA疫苗能夠刺激機體產生具有抗原專一性的免疫反應,是預防和治療疾病的重要和有效途徑。疫苗免疫能夠產生免疫記憶細胞,再次遇到抗原將會在短時間內大量地擴增特異性的免疫細胞,重要的是疫苗免疫能夠產生抗原特異性的。本研究探討了免疫耐受佐劑作為DNA疫苗佐劑對Treg細胞誘導產生的影響。不同免疫抑制劑對Treg細胞的影響不同[13-15],因此我們比較了FK506、CsA或MMF作為DNA疫苗佐劑,對誘導Treg細胞的影響,結果表明FK506能夠誘導Treg細胞的產生,而CsA或MMF卻不能。因此我們選用FK506作為DNA疫苗佐劑,并發現免疫后小鼠T細胞增殖反應顯著受到了抑制。

DCs是目前已知體內效力最強的專職抗原遞呈細胞(APC),具有向免疫細胞遞呈抗原、影響T細胞亞群分化和誘導免疫耐受等功能。DCs以成熟DCs和不成熟DCs兩種狀態存在。機體內不成熟DCs可誘導產生抗原特異性Treg細胞[16,17]。本研究證明FK506作為DNA疫苗佐劑能夠抑制小鼠DCs細胞的成熟,增加分泌抑制型細胞因子IL-10的產生,進而上調Treg細胞的比例,并降低EAE的發病癥狀。

綜上所述,FK506作為DNA疫苗佐劑能夠顯著抑制小鼠DCs細胞的成熟,能夠分泌抑制型細胞因子IL-10,刺激Treg細胞的產生,并且能夠預防EAE的發病,為自身免疫疾病的研究提供了新的方法和思路。

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