小檗堿對DC-CIK增殖和殺瘤活性影響的初步研究①

危曉莉 王 媚 潘佩蕾 陳麗芬 (浙江大學醫學院,杭州310058)

許多中藥及中藥復方可誘導細胞產生細胞因子或具有細胞因子樣作用,且能增加免疫細胞活性,故可用于腫瘤的生物治療。本課題研究了小檗堿(Berberine,Ber)對外周血來源DC和CIK增殖和殺HepG-2活性的影響,探討小檗堿應用于腫瘤過繼免疫治療的潛能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CD3McAb(美國eBioscience公司);rhIL-1β、rhIL-2、rhIL-4、rhGM-CSF 、rhIFN-γ(美國 PEPROTECH公司);MTT、小檗堿(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備HepG-2腫瘤細胞凍融物抗原 消化、收集對數生長期的HepG-2細胞,PBS調整濃度為4×107ml-1,反復凍融3次,離心取上清,過濾除菌,-20℃保存備用。

1.2.2 人外周血來源DC的誘導培養 Ficoll密度梯度離心法分離無菌肝素抗凝外周血單個核細胞(PBMC),細胞培養板孵育2小時后,懸浮細胞誘導擴增CIK,貼壁的單核細胞誘導生成DC,DC培養液中rhIL-4(500 U/ml)、rhGM-CSF(1 000 U/ml)。48小時后DC分為兩組,一組加入小檗堿3μmol/L,另一組為陰性對照組,繼續培養72小時后,兩組均加入HepG-2腫瘤細胞凍融物抗原20μg/ml。

1.2.3 IL-12檢測 培養第8天收集兩組DC上清,ELISA法檢測IL-12水平。

1.2.4 CIK體外誘導擴增 上述懸浮細胞加入IFN-γ1 000 U/ml,37℃,5%CO2培養24小時后加入IL-1 10U/ml、CD3McAb 50 ng/ml、IL-2 300U/m1,每 3天半量換液1次。

1.2.5 DC和CIK共培養 第8天分別收集兩組DC和CIK,計數并調整其濃度,按DC∶CIK 為1∶5和1∶10混合共培養,每3天補充IL-2 300 U/ml,第15天收集各組細胞并計數。

1.2.6 DC-CIK對HepG-2殺傷活性檢測 收集培養第15天各組DC-CIK共培養細胞作為效應細胞,收集對數生長期HepG-2肝癌細胞作為靶細胞,按DC-CIK 與HepG-2效靶比分別為5∶1,10∶1,20∶1混合,另設DC-CIK效應細胞對照和HepG-2靶細胞對照,均設3個復孔,37℃,5%CO2孵育12小時,MTT法檢測各孔OD值并計算殺傷率,殺傷率(%)=[1-

1.3 統計學處理 使用Stata7.0軟件,進行自身配對t檢驗及方差分析,P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 DC的形態學觀察 培養第8天,鏡下觀察小檗堿組DC較陰性對照組DC長勢好,大部分細胞懸浮不貼壁,聚集成簇,為細胞集落,平均每個視野細胞集落明顯多且大,細胞胞體較大,見毛刺狀突起,形態不規則。

2.2 小檗堿對DC、DC-CIK細胞增殖能力的影響血球計數板直接計數培養第8天小檗堿組與陰性對照組DC,結果顯示:小檗堿組DC較陰性對照組明顯增多,P＜0.01,差異具有統計學意義;DC與CIK細胞共培養24小時見DC與較多CIK細胞聚集成團,培養第15天見DC-CIK細胞群增殖迅速,成團塊狀生長,大小均一。兩組 DC-CIK計數結果顯示:DC∶CIK=1∶5時,小檗堿組DC-CIK 增殖能力明顯高于陰性對照組,P＜0.05,差異具有統計學意義,DC∶CIK=1∶10時,小檗堿組DC-CIK增殖能力高于陰性對照組,但P＞0.05,差異無統計學意義(表1)。

2.3 小檗堿對DC產生IL-12能力的影響 DC培養上清中IL-12含量小檗堿組為27.37±8.09 pg/ml,陰性對照組為30.83±11.24 pg/ml,兩組相比 P＞0.05,差異無統計學意義。

2.4 小檗堿組和陰性對照組DC-CIK對HepG-2殺傷活性的比較 當DC與CIK同一混合比例,DCCIK與HepG-2同一效靶比時,小檗堿組和陰性對照組的殺傷率比較P＞0.05;當DC與CIK不同混合比例而DC-CIK與HepG-2同一效靶比時,小檗堿組和陰性對照組的殺傷率比較P＞0.05,差異均無統計學意義;每組組內隨著效靶比的增高殺傷率增高,其中DC∶CIK為1∶5時小檗堿組殺傷率和DC∶CIK為1∶10時陰性對照組殺傷率組內比較P＜0.05,差異有統計學意義,其差異均主要是來自于效靶比為5∶1和20∶1時的差異(表2)。

表1 小檗堿組與陰性對照組的 DC和CIK增殖能力的比較(105/ml,±s,n=12)Tab.1 The comparison of DC and CIK proliferation between Berberine group and negative control group(105/ml, ±s,n=12)

表1 小檗堿組與陰性對照組的 DC和CIK增殖能力的比較(105/ml,±s,n=12)Tab.1 The comparison of DC and CIK proliferation between Berberine group and negative control group(105/ml, ±s,n=12)

Note:1)Compared with negative control group P＜0.01;2)Comparedwith negative control group P＜0.05.

Groups DC DC-CIK DC∶CIK=1∶5 DC∶CIK=1∶10 Berberine group 3.785±2.0961) 8.142±2.9092) 12.358±6.367 Negative control group 2.684±1.496 5.900±1.96 9.375±2.420

表2 小檗堿組和陰性對照組 DC-CIK對 HepG-2的殺傷活性及比較(%,±s,n=9)Tab.2 The comparison of killing Hep G-2 activity of DC-CIK between Berberine group and negative control group(%,±s,n=9)

表2 小檗堿組和陰性對照組 DC-CIK對 HepG-2的殺傷活性及比較(%,±s,n=9)Tab.2 The comparison of killing Hep G-2 activity of DC-CIK between Berberine group and negative control group(%,±s,n=9)

Note:1)As the ratio of DC∶CIK is 1∶5,the killing rateis compared among the Berberinegroup,P ＜0.05;2)As the ratio of DC∶CIK is 1∶10,the killing rate is compared among the negative control group,P＜0.05.

Groups DC∶CIK=1∶5DC∶CIK=1∶10 5∶1 10∶1 20∶15∶1 10∶1 20∶1 Berberine Group 63.0±11.91) 70.4±11.8 80.9±9.1 62.8±10.1 72.2±11.8 73.9±8.3 Negative Control group 68.8±11.0 69.0±12.0 72.8±10.9 65.7±5.82) 73.4±10.4 78.5±9.3

3 討論

DC聯合CIK治療腫瘤在體內外試驗中均顯示出強大的殺傷活性和眾多的優勢[1,2],但其突出的缺點是成本高,特別是制備所需的細胞因子價格昂貴,極大的限制了其臨床應用率。有些學者將注意力轉向外源性物質誘導內源性細胞因子產生,進而取代輸入外來重組品的思路上來。實驗與臨床研究證實,許多中藥及中藥復方可誘導細胞產生細胞因子或具有細胞因子樣作用,可減少細胞因子用量,且能增加免疫細胞活性,故對于腫瘤的治療,包括直接的抗腫瘤治療和過繼免疫治療都是十分有利的[3-5]。小檗堿是一味古老抗菌藥,近年來研究發現其對一些腫瘤有直接抗腫瘤作用[6],其是否具有間接抗腫瘤作用呢?Kang等[7]實驗證明小檗堿可以增加LPS激活的巨噬細胞IL-12、IFN-γ表達,可抑制抗原刺激的CD4+T細胞分泌IL-4,且使CD4+T細胞偏離Th2而向Th1分化,這為小檗堿用于抗微生物和抗腫瘤作用提供了新的解釋。本實驗中,培養7天后小檗堿組細胞數比陰性對照組高出1.5倍左右,形態更成熟,DC與CIK共培養時,小檗堿組DC-CIK細胞比陰性對照組多,說明小檗堿能促進DC的增殖,能增強DC刺激淋巴細胞增殖的能力。而DC分泌IL-12水平兩組沒有明顯差別,說明小檗堿促進淋巴細胞增殖的能力不是通過提高IL-12分泌水平來實現的 ,當然是否通過促進 DC 分泌 IFN-γ、IL-1、IL-2,即CIK誘導細胞因子,來促進CIK的增殖還有待進一步研究。小檗堿對DC-CIK殺HepG-2活性無明顯影響,表明小檗堿不影響DC-CIK殺傷腫瘤細胞的能力。綜上所述,小檗堿能促進DC和DC-CIK的增殖,對DC-CIK單細胞殺腫瘤活性沒有影響,其促進DC和DC-CIK增殖的機制可能是因為小檗堿具有類細胞因子的作用,但也可能有其他作用機制的影響,還有待于進一步的研究。鑒于本實驗結果我們可初步認為小檗堿有可能用于臨床DC-CIK的過繼免疫治療,對降低CIK的制備成本,提高DC-CIK臨床應用率有重要意義。

1 Angena M,Sabing R,Marie LT et al.Enhanced lysis activity of cytokine induced killer cells against multiple myeloma cells after co-culture with idiotype-pulsed dendritic cells[J].Haematologica,2001;86(10):1029-1037.

2 王新帥,祁巖超,王遠東 et al.臍血來源樹突狀細胞增強CIK細胞對肺癌細胞株的殺傷作用[J].國際醫藥衛生導報,2005;11(18):18-20.

3 朱京元.T淋巴細胞轉化和LAK細胞制備中五種中藥效用的實驗觀察[J].臨床輸血與檢驗,2001;3(3):6-8.

4 王 光,周正任,婁 丹 et al.黃芪多糖對IL-2/LAK抗腫瘤增強作用的動物實驗研究[J].中國免疫學雜志,1994;10(6):359-361.

5 李金鋒,黃信孚,林本耀.豬苓多糖對小鼠NK、LAK活性的影響[J].中華微生物學和免疫學雜志,1995;15(2):89-91.

6 劉 澤,蔡少平.小檗堿抑制結腸癌細胞中COX-2表達作用的研究[J].中國新藥雜志,2004;13(9):796-799.

7 Kang BY,Chung SW,Cho D et al.Involvement of p38mitogen-activated protein kinase in the induction of interleukin-12 p40 production in mouse macrophages by berberine,a benzodioxoloquinolizinealkaloid[J].Biochem Pharimacol,2002;63(10):1901-1910.