類風濕關節炎患者淋巴細胞協同刺激分子和活化標志的表達及意義

程金華

類風濕關節炎（RA）是以多關節滑膜慢性炎癥導致滑膜成纖維母細胞增生、大量淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞浸潤為特征的一種常見自身免疫性疾病。研究發現，淋巴細胞活性及其信息傳遞異常與RA的發生密切相關。我們采用流式細胞儀分析RA患者外周血和關節滑膜液淋巴細胞協同刺激分子CD28/B7（CD80或CD86）、CDl54（CD40L）/CD40和淋巴細胞活化標志CD25、人白細胞DR抗原（HLA-DR）的表達，以探討這些指標在BA診斷和治療中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

30例RA患者，女24例，男6例，年齡27～65歲，均符合1987，年美國風濕病協會修訂的類風濕關節炎診斷標準，健康獻血者20名，女16名，男4名，年齡23～55歲。均抽取空腹靜脈血2mL，經EDTA-K2抗凝備用。另20例RA患者的關節滑膜液取自齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院骨科行膝關節置換或滑膜切除術者，女15例，男5例，年齡23～41歲。對照組的關節滑膜液取自因外傷截肢的10名正常人，兩組年齡、性別差異無統計學意義。

1.2 關節滑膜液淋巴細胞分離

關節滑膜液用20IU/mL肝素抗凝，3000r/min離心10min，棄上清液，淀物加PBS重懸，用淋巴細胞分離液（Ficoll）分離制備淋巴細胞（1500r/min離心15min），調整細胞濃度至1×106/mL，用于流式細胞儀檢測，6h內完成。

1.3 外周血淋巴細胞協同刺激分子的表達

采用雙色熒光染色，在FALCON試管（美國BD公司）中加入20μL異硫氰基熒光素（FITC）標記的抗CD3單抗，藻紅蛋白（PE）標記的抗CD28單抗或抗CD154（CD40L）單抗。同樣在FALCON試管中加20μLFITC標記的抗CDl9單抗，PE標記的抗CD80單抗或抗CD86單抗或抗CD40單抗及雙色同型對照免疫球蛋白（均為美國BD公司產品），分別與100μL抗凝血充分混勻，室溫暗處反應15min。加1×FACS溶血素（美國BD公司）2mL，充分混勻，室溫暗處反應10min。1000r/min離心5min，棄上清液，加PBS 2mL，充分混勻。1000r/min離心5min，棄上清液，加0.5血PBS，充分混勻，24h內上流式細胞儀分析。

1.4 外周血淋巴細胞活化標志的表達

采用三色熒光染色，在FALCON試管中加入20μL FITC標記的抗CD19單抗、PE標記的抗CD25單抗或抗HLA-DR單抗及葉綠素蛋白（Percp）標記的抗CD3單抗和三色同型對照免疫球蛋白（均為美國BD公司產品），分別和100μL抗凝血充分混勻，室溫暗處反應15min，其余操作同方法3。

1.5 關節滑膜液淋巴細胞協同刺激分子和淋巴細胞活化標志的表達

均采用雙色熒光標記，分別和100μL 1×106/mL細胞數的關節滑膜液充分混勻，室溫暗處反應15min，加0.5mL PBS，充分混勻，24h內上流式細胞儀分析。

1.6 流式細胞分析

FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）開機后以CaliBRITE 3熒光微球和FACSComp自動軟件檢查儀器靈敏度，并自動設定試驗獲取條件，包括光電倍增管（PMT）電壓和熒光補償等。用CellQuest軟件對樣本試驗獲取條件作進一步優化，并檢測各組樣本管，獲取10000個細胞后，用Cell Quest軟件分析各CD分子在淋巴細胞中免疫熒光陽性細胞的百分率。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 外周血淋巴細胞協同刺激分子的表達

RA患者外周血中，B淋巴細胞CD86表達陽性率（1.9%±10.9%）與正常對照組（6.1±2.3）%相比明顯下降（P＜0.01），同時B淋巴細胞CD40表達陽性率（17.3±7.7）%比正常對照組（12.4%±3.1%）明顯增多（P＜0.05）；而B淋巴細胞CD80表達陽性率（2.4%±0.9%）與正常對照組（2.0±0.8）%相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。T淋巴細胞CD28、CD154表達陽性率（48.8±8.8）%和（0.2±0.1）%與正常對照組（48.8±5.8）%和（0.2±0.2）%相比差異也無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 類風濕關節炎患者外周血B淋巴細胞共刺激分子CD80、CD86和CD40的表達

2.2 關節滑膜液淋巴細胞協同刺激分子的表達

RA患者關節滑膜液中B淋巴細胞CD80、CD86和CD40表達陽性率（0.4±0.2）%、（1.3±0.8）%和（0.6±0.3）%與正常對照組（0.3±0.2）%、（3.6±2.4）%和（0.4±0.4）%相比差異無統計學意義（P＞0.05）。RA患者組T淋巴細胞CD28、CD154表達陽性率（8.0±2.0）%和（0.4±0.2）%與正常對照組（7.2±2.6）%和（0.4±0.1）%相比，差異亦無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 外周血淋巴細胞CD25和HLA-DR的表達

RA患者外周血中，T淋巴細胞CD25表達陽性率和B淋巴細胞CD25表達陽性率與正常對照組比均明顯增多（P＜0.01），T淋巴細胞和B淋巴細胞的HLA-DR表達陽性率與正常對照組比差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 RA患者外周血淋巴細胞CD25和HLA-DR的表達（±s，%）

表1 RA患者外周血淋巴細胞CD25和HLA-DR的表達（±s，%）

注：*與對照組比較P＜0.01

2.4 關節滑膜液淋巴細胞CD25和HLA-DR的表達

RA患者關節滑膜液中，T淋巴細胞HLA-DR表達陽性率明顯增多（P＜0.01），而CD25表達陽性率與正常對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；但B淋巴細胞HLA-DR和CD25表達陽性率明顯增多（P＜0.01），見表2。

表2 RA患者關節滑膜液淋巴細胞CD25和HLA-DR的表達（±s，%）

表2 RA患者關節滑膜液淋巴細胞CD25和HLA-DR的表達（±s，%）

注：*與對照組比較P＜0.01

3 討 論

CD25和HLA-DR是細胞活化的標志。在本試驗中，RA患者外周血T、B淋巴細胞CD25表達與正常對照組相比均明顯增多，關節滑膜液B淋巴細胞CD25表達和T、B淋巴細胞HLA-DR表達與正常對照組相比亦明顯增多，表明RA患者在外周血和關節滑膜液中均有活化的T、B淋巴細胞明顯增多現象[1,2]。但對RA不同時期的免疫活性細胞的活化程度問題，還需進一步研究確定。

免疫活性細胞的增多表明RA患者局部和全身免疫功能亢進。淋巴細胞被激活主要依靠協同刺激分子及其相應的配體，在誘導胸腺依賴抗原（TD-Ag）特異性免疫應答中，協同刺激信號CD28/B7（CD80或CD86）是T細胞活化的重要因素，在免疫反應中起著關鍵作用；協同刺激信號CD154（CD40L）/CD40參與B細胞的應答，亦參與T細胞依賴抗原（TD-Ag）誘發的免疫應答。在免疫反應中，CD86介導的協同刺激作用是激發T細胞反應的關鍵，而CD80介導的協同刺激作用可能可維持和擴展T細胞反應的進行。協同刺激信號在調節淋巴細胞亞群分化中起著重要作用。Kuchroo等報道，雖然CD80和CD86對T細胞的增生都提供協同刺激作用，但CD80可激發Thl型細胞反應，而CD86則激發Th2型細胞反應。Kitagawa等認為，CD40與CD154的相互作用可上調RA患者體內白細胞介素12的水平，從而促使Thl細胞分泌細胞因子明顯增多，最終導致Thl/Th2細胞分泌的細胞因子失衡。在本研究中，RA患者外周血B淋巴細胞CD86表達比正常對照組明顯減少，B淋巴細胞CD40表達比正常對照組明顯增多，表明RA患者存在淋巴細胞協同刺激分子的異常表達，這些淋巴細胞協同刺激信號傳導異常可能與RA患者體內Th2細胞分泌的細胞因子水平明顯下降，Thl細胞分泌的細胞因子水平升高，Thl/Th2細胞分泌的細胞因子失衡密切相關。

雖然，RA的發病機制至今不明，但是研究淋巴細胞活化及其信號傳導異常，進而改變細胞信號異常傳遞、平衡促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子的分泌，阻斷淋巴細胞的過度激活機制，將為臨床診斷和治療RA提供新的思路。

[1]Skapenko A, Lip sky PE, Kraetsch HG, et al. Antigen-independentTh2 cell differentiation by stimulation of CD28: regulation via IL-4 gene expression and mitogen-activated protein kinas activation[J].J Immunol, 2001, 166:4283-4296.

[2]Caruso A, Licenziati S, Corulli M, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation[J].Cytometry,1997,27:71-76.

[3]Salomon B, Bluestone JA.Complexities of CD28/BT: CTLA-4costimulatory pathways in autoimmunity and transplantation[J].Annu Rev Immunol, 2001, 19:225-252.

[4]冷建杭,蔣群芳,姜曉虹,等.類風濕關節炎血清和滑液Thl/Th2細胞因子的水平及意義[J].浙江臨床醫學,2004,6:457-458.