柱前衍生化高效液相色譜法測定 L－半胱氨酸原料中光學雜質

孫寶丹，董 斌，王 旭，郭興杰

(沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110016)

半胱氨酸是一種具有巰基基團的天然氨基酸，僅在220 nm波長處有末端吸收[1]，采用液相色譜紫外檢測法難以達到高檢測靈敏度。因此，許多文獻采用柱前衍生化高效液相色譜法測定半胱氨酸的含量[2]。為了提高半胱氨酸的測定靈敏度，筆者用4－氯－7－硝基 －2，1，3－苯并二唑(NBD－Cl)作為柱前衍生化試劑制備半胱氨酸衍生物，在Sumichiral OA－2500S手性柱上分離兩對映體，建立左旋半胱氨酸原料藥中右旋異構體雜質的檢查方法，并對影響對映體分離的因素進行了研究和討論。

1 儀器與試藥

Jasco高效液相色譜儀，PU－2080型高壓泵，Jasco UV－2075型紫外檢測器(日本分光公司);Sepu 3000色譜工作站(山東金普分析儀器有限公司);pHS－3DC型精密數顯酸度計(上海科學公司)。L－半胱氨酸對照品、D－半胱氨酸對照品、L－半胱氨酸原料(遼寧一成藥業有限公司);NBD－Cl(New Jersey，USA);甲醇、乙腈(色譜純，山東禹王實業有限公司化工分公司)，其他試劑均為化學純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Sumichiral OA －2500S 柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇(含15 mmol/L檸檬酸)－乙腈溶液(10∶90，V/V);流速:0.8 mL/min;柱溫:室溫;檢測波長:470 nm;進樣量:20 μL。

2.2 溶液制備

稱取0.31 g硼酸和0.37 g氯化鉀，溶于30 mL水中，用0.1 mol/L氫氧化鈉調pH至8.0，用水定容至50 mL，即得硼酸鹽緩沖液。用硼酸鹽緩沖溶液為溶劑，制備質量濃度為300 μg/mL的 D－半胱氨酸對照品貯備液和質量濃度為600 μg/mL的 L－半胱氨酸對照品貯備液;分別吸取上述貯備液適量，用硼酸鹽緩沖液稀釋制成質量濃度均為100 μg/mL的 D－半胱氨酸和 L－半胱氨酸混合對照品溶液;吸取 D－半胱氨酸對照品貯備液適量，用硼酸鹽緩沖液稀釋成質量濃度為100 μg/mL的對照品溶液(置4℃冰箱中保存)。精密稱取NBD－Cl適量，用甲醇溶解并配制成質量濃度為16 mmol/L的NBD－Cl溶液，置4℃冰箱中避光保存待用。

2.3 衍生化反應

取氨基酸溶液 400 μL，加入 NBD －Cl溶液 300 μL，于 60 ℃水浴中避光反應60 min，4℃冷卻，氮氣吹干，加流動相1 mL復溶，0.2μm 濾膜濾過。

2.4 檢測條件優化

衍生化條件:使用質量濃度為300 μg/mL的 L－半胱氨酸對照品溶液考察了影響衍生化反應的因素[3－4]。結果表明，衍生化試劑濃度、衍生溶液pH、衍生化溫度及時間對衍生化產率均有影響。優化的衍生化條件為NBD－Cl的濃度為16 mmol/L，衍生溶液pH為8.0，衍生化溫度及時間分別為60℃和60 min。

色譜條件:設定甲醇中檸檬酸濃度為5 mmol/L，考察了甲醇與乙腈比例在10∶90至50∶50范圍內對氨基酸對映體分離的影響。由表1可知，隨著乙腈比例的增加，氨基酸對映體保留時間明顯縮短，但分離度和選擇性因子改變不大。因此，考慮到乙腈比例再增加會影響檸檬酸在流動相中的溶解，最后選擇甲醇與乙腈比例為10∶90。甲醇中檸檬酸濃度對對映體分離也有影響[5－6]。設定甲醇與乙腈比例為10∶90，考察了檸檬酸濃度(0～20 mmol/L)對氨基酸對映體分離的影響。流動相中不含檸檬酸時，對映體保留時間過長;檸檬酸濃度增加，對映體保留時間減小，分離度減小。綜合考慮保留時間和分離度，最后選擇檸檬酸濃度為15 mmol/L。

表1 甲醇和乙腈的不同比例對分離的影響

2.5 方法學驗證

專屬性試驗:取混合對照品溶液和 D－半胱氨酸對照品溶液，按2.3項下方法操作，制備NBD－半胱氨酸衍生物，同時制備空白溶液，在上述色譜條件下進樣，色譜圖見圖1。可見，D－半胱氨酸和 L－半胱氨酸達到完全分離，按 L－半胱氨酸計理論板數為8400;空白衍生化試劑在半胱氨酸保留時間處無色譜峰出現，表明衍生化試劑對測定無干擾。

線性關系考察:精密量取 D－半胱氨酸對照品貯備液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，置 100 mL 量瓶中，加硼酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻。按2.3項下方法進行衍生化，在上述色譜條件下進樣，記錄色譜圖。以峰面積(Y)為縱坐標、質量濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，回歸方程為 Y=70523 X －385，R2=0.9992(n=5)。結果表明，D－半胱氨酸質量濃度在1.2～6.0 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。方法的最低檢測限為2.5 ng，最低定量下限為6 ng。

重復性試驗:分別量取 D－半胱氨酸和 L－半胱氨酸對照品貯備液適量，稀釋制成含 D－半胱氨酸3 μg/mL和 L－半胱氨酸300 μg/mL的混合對照品溶液6份，按2.3項下方法操作，進樣分析。結果峰面積的 RSD為1.9%(n=6)，表明方法重現性良好。

回收率試驗:取 200 μL質量濃度為600 μg/mL的 L－半胱氨酸對照品貯備液，分別加入 200 μL 質量濃度為 3，6，9 μg/mL的 D－半胱氨酸對照品溶液(n=9)，作為供試品溶液，按2.3項下方法進行衍生化，依法測定并計算回收率。結果平均回收率為102.5%，RSD 為 3.0%(n=9)，表明方法準確度良好。

2.6 樣品雜質檢查

取 L－半胱氨酸原料藥適量，精密稱定，加硼酸鹽緩沖溶液溶解制成每1 mL中約含300 μg L－半胱氨酸的溶液，作為供試品溶液;另精密量取D－半胱氨酸對照品貯備液適量，用硼酸鹽緩沖溶液稀釋成每 1 mL 中含 3.0 μg D－半胱氨酸的溶液，作為對照溶液。精密量取對照溶液 20 μL，注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分的峰高約為滿量程的20%;另取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分完全出峰，按外標法計算 L－半胱氨酸中 D－異構體的含量，即得。結果表明，本研究所用的 L－半胱氨酸原料藥中未檢出右旋體雜質。

圖1 半胱氨酸衍生化產物色譜圖

3 討論

本研究首次采用NBD－Cl對半胱氨酸進行柱前衍生，并使用OA手性色譜柱分離半胱氨酸衍生物對映體。在此基礎上，建立了L－半胱氨酸原料藥中右旋異構體雜質的檢查方法，為控制 L－半胱氨酸的光學純度提供了保證。

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