HST－302血細胞分析流水線有關復檢規則的建立

杜 丹，胡成進，孔立新，王延群，孫子涵，孫 黎，林 靜

隨著自動血細胞分析技術的飛速發展，及全自動血細胞分析儀的廣泛使用，傳統的血涂片顯微鏡檢查法，逐漸成為儀器檢測結果的補充方法。但眾所周知，血細胞分析儀白細胞分類計數功能僅體現在血細胞形態和比率大致正常的情況下，當存在形態異常的細胞時，儀器便很難準確識別分辨，此時必須進行涂片復檢[1]。如何更好的將儀器法提供的參數與人工鏡檢相結合，為臨床提供更加準確完善的檢測報告，是目前各國血液學專家都在共同關注的課題[2-6]。國際血液學復檢專家組歷時3年通過對13 298份血液學標本進行分析后，于2005年提出了41條自動血細胞分析和分類復檢規則（后簡稱“國際復檢規則41條”）[6]，2008年叢玉隆教授帶領的“XE－2100復檢協作組”聯合國內三家大型醫院用1年的時間通過對3 594份臨床血液標本的分析，制定了適合中國人群應用XE－2100血細胞分析儀的白細胞分類涂片復檢規則23條（后簡稱“XE－2100復檢規則23條”）[7]。但由于各實驗室所使用血細胞分析儀的性能特點不同，醫院規模及病種差異不同，即使是同一型號的儀器因實驗室要求不同，篩選標準也可不同，因此各實驗室應根據自身特點制定適應實驗室應用的血細胞復檢規則。為此，筆者結合所在實驗室儀器特點及醫院要求，在 “XE－2100復檢規則23條”的基礎上，結合“國際復檢規則41條”，制定了適合所在實驗室常規工作需求的自動血細胞計數與WBC分類的復檢規則。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 1 212份血常規標本，EDTA-K2抗凝，均來自濟南軍區總醫院住院患者，其中初診標本934份，復診標本278份，所有標本均在采血后4 h內檢測完畢并推片染色。

1.1.2 儀器與試劑 主要儀器為Sysmex HST－302全自動血細胞分析流水線，包括Sysmex XE－2100全自動血細胞分析儀2臺，SP－1000i自動推片機1臺，原裝配套試劑、質控品均由日本Sysmex公司提供。Olympus雙筒顯微鏡購自日本奧林巴斯光學株式會社。

1.2 方法

1.2.1 儀器的調試與校準 評估前，由Sysmex公司的工程師用Sysmex校準物對2臺儀器進行校準，并將儀器的靈敏度調整到同一水平，然后用高中低三個水平的質控品對2臺儀器進行比對，保證儀器間結果一致性。試驗期間每日均用全血質控品進行嚴格的室內質量控制，以監測結果的準確性和穩定性。

1.2.2 檢測方法 所有標本按臨床標本的常規檢測流程和方法進行全血細胞分析檢測并推片瑞氏染色，由推片機自動編號打印日期，由長期從事細胞工作并具有中級以上職稱的檢驗人員按照文獻[2]方法進行鏡檢。每張血涂片由2人分別鏡檢，取平均值。內容包括：①WBC分類計數：每人計數100個WBC，取均值為人工WBC分類值，并進行形態學觀察；②WBC和PLT數量評估；③RBC和PLT的大小、染色及形態學觀察；④有無巨大血小板及血小板聚集；⑤NRBC、RBC冷凝集及寄生蟲等。

1.2.3 初步復檢規則的制定 按照國內 “XE－2100復檢協作組”制定的“XE－2100復檢規則23條”執行[7]。

1.2.4 血涂片陽性判斷標準 按照全國血液學復檢專家小組提出的12條血細胞自動計數復檢標準執行[9]。①紅細胞明顯大小不等（指細胞大小相差1倍以上）；中空淡染 （指>1/2淡染區的紅細胞＞30%）；②巨大血小板＞15%；③見到血小板聚集；④Dohle小體的粒細胞＞10%；⑤中毒顆粒中性粒細胞＞10%；⑥空泡變性粒細胞＞10%；⑦原始和幼稚細胞≥1%；⑧早幼粒細胞和中幼粒細胞≥1%；⑨晚幼粒細胞＞2%；⑩異型淋巴細胞＞5%；⑾NRBC≥1%；⑿漿細胞≥1%。

1.2.5 初檢規則的評估方法 將“XE－2100復檢規則23條”輸入XE－2100血細胞分析儀的Laboman4.2程序，儀器結果觸發任一條規則即為儀器陽性，以人工鏡檢的結果對初檢規則進行評估，以鏡檢結果為金標準，評估初檢規則對標本判斷的真陽性、假陽性、真陰性、假陰性，并進行統計學分析。真陽性定義為觸發規則且鏡檢結果為陽性；假陽性定義為觸發規則但鏡檢結果為陰性；真陰性定義為不觸發規則且鏡檢結果為陰性；假陰性定義為不觸發規則但鏡檢結果為陽性。

1.3 統計學分析 試驗數據采用XE－2100復檢協作組與Sysmex公司聯合開發專用的Laboman4.2軟件及Microsoft Excel軟件進行統計學分析。

2 結 果

2.1 初檢規則的應用評估 通過對1 212份標本的儀器檢測結果和人工鏡檢結果對比，對“XE－2100復檢規則23條”進行評估，統計結果顯示真陽性率47.5%（576/1 212），假陽性率 14.6%（177/1 212），真陰性率29.0%（351/1 212），假陰性率 8.9%（108/1 212），通過對23條規則詳細對比分析顯示，假陽性出現較多的規則是嗜堿性粒細胞絕對值、未成熟粒細胞、核左移、原始細胞和有核紅細胞；假陰性出現最多的規則是未成熟粒細胞及核左移，其次是異型淋巴細胞、原始細胞和少量的有核紅細胞，閱片過程中發現PLT聚集、巨大血小板2項出現假陰性頻率較高。

2.2 筆者所在實驗室XE－2100血細胞復檢規則的制定 根據對“XE－2100復檢規則23條”的評估結果，及初檢規則觸發情況的詳細分析，結合“國際復檢規則41條”，初步擬定了適合筆者所在實驗室常規工作要求及儀器特點的血細胞分析復檢規則（表1）。

2.3 驗證試驗 為了驗證制定的復檢規則的有效性，將其設置在XE－2100的Laboman4.2軟件中，選擇200份標本進行驗證，并與人工鏡檢結果進行對比分析，結果顯示該規則的復檢率為26.5%（53/200）， 真陽性率為 44.5%（89/200）， 假陽性率為19.0%（38/200），真陰性率為 33.0%（66/200），假陰性率為3.5%（7/200）。假陽性主要由嗜堿性粒細胞絕對值、未成熟粒細胞、核左移和有核紅細胞引起，假陰性主要由巨大血小板、血小板聚集、異形淋巴細胞和少量有核紅細胞引起。

3 討 論

“XE－2100復檢規則23條”在筆者所在實驗室Sysmex HST－302全自動血細胞分析流水線上應用后發現，1 212份標本中，假陽性出現較多的規則是嗜堿性粒細胞絕對值、未成熟粒細胞、核左移，還有少量原始細胞和有核紅細胞，假陰性出現最多的規則是未成熟粒細胞及核左移，其次是異型淋巴細胞、PLT聚集、巨大血小板、原始細胞和少量的有核紅細胞。由此可見出現假陽性和假陰性較多的規則集中在未成熟粒細胞、核左移，原始細胞和有核紅細胞幾項，經反復測試多方查找原因后發現：①筆者所在實驗室所用2臺XE－2100血細胞分析儀并未開通有核紅通道，故對有核紅細胞的陽性報警僅能作為參考信息，工作人員應在此基礎上進行人工鏡檢，計數有核紅細胞百分數，并計算校正后白細胞總數；② XE－2100五分類血細胞分析儀對未成熟粒細胞的檢測方法為射頻加阻抗法，對幼稚細胞的識別應該較為準確，復查核對中發現部分未成熟粒細胞出現假陰性且白細胞未分類的標本，在IPU里已有未成熟粒細胞報警信息提示，而且超出了陽性臨界值，但Labomanr4.2卻沒有提示未成熟粒細胞陽性，其原因可能與未分類標本的相關設置有關，或者為IPU和Laboman4.2之間的傳輸問題，上述標本因未分類觸發了DC規則，所以并未造成漏檢，但該問題已與廠家工程師聯系期待有效解決，避免在以后的工作中造成漏檢；③嗜堿性粒細胞絕對值假性偏高是近期出現的問題，尤其是肺癌等腫瘤化療患者其散點圖出現明顯拖尾現象，筆者抽取部分假陽性標本用其他實驗室的同型號儀器進行檢測，結果全部陰性，即無一例提示嗜堿性粒細胞絕對值偏高。該結果提示，筆者所在實驗室使用的XE－2100血細胞分析儀在嗜堿性粒細胞計數方面敏感度偏高，應對儀器進行重新校正后使用。另一方面，筆者所在醫院近期更換了部分2 ml肝素抗凝管，有可能這種型號的抗凝管儲存的標本會對儀器的檢測造成一定影響。另外，巨大PLT假陰性率較高，可能是由于儀器在分類時將部分巨大PLT誤認為小淋巴細胞所致，故在復檢規則里添加了MPV報警一項，以期進一步降低假陰性率。

表1 筆者所在實驗室HST－302血細胞分析流水線復檢規則25條

在本次評估中發現Sysmex XE－2100全自動血細胞分析儀在細胞計數方面的準確度比較高，其白細胞分類的絕對值和百分率與人工鏡檢分類的結果有較好的符合度，“XE－2100復檢規則23條”中3－14條計數規則基本符合筆者所在實驗室的工作需求，出現的假陽性和假陰性率都較低，因此在后續規則的制定中未做較多調整。但對部分異常細胞的判斷儀器報警與人工鏡檢結果有一定偏差，如紅細胞大小不等、中空淡染、異形淋巴細胞和巨大血小板等，這可能與儀器的靈敏度有關，也與閱片者的技術水平及涂片中細胞分布的差異有關。但在目前的研究中尚未有因紅細胞形態異常造成假陽性或假陰性的情況出現。

在制定復檢規則的過程中，根據評估結果并結合臨床醫師的建議，對“XE－2100復檢規則23條”進行了部分調整。所遵循的原則是：①建立一份適合筆者所在實驗室實際工作需求的復檢規則；②在保證篩選質量的基礎上盡量降低復檢率；③假陰性率控制在5%以下，具有診斷意義的重要參數不能出現假陰性；④在較低假陰性的基礎上降低假陽性率[1]。筆者針對導致假陰性和假陽性較高的規則做了相應調整，增加了PLT聚集和巨大PLT兩項。驗證結果表明，假陽性率（19.0%）有所提高但未超過血液學復檢專家組認可的許可范圍，假陰性率降至為3.7%，符合血液學復檢專家組認可的<5%的許可范圍，并且血液病標本無漏檢。

臨床實驗室制定的涂片復審標準使用后，隨著儀器使用時間延長應定期對復檢規則進行評估校正，不斷改進和完善以保證其與儀器的匹配度長期有效。

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