接種根瘤菌與施肥對岷山紅三葉異黃酮含量的影響

孟祥君,俞聯平,程文定,王國生

（甘肅省草原技術推廣總站,甘肅 蘭州 730010）

①紅三葉Tri folium pratense為豆科車軸草屬[1]多年生牧草,又名紅車軸草、紅荷蘭翅搖、金菜花、紅花苜蓿等。紅三葉中富含異黃酮類化合物,具有抗腫瘤（胃癌、乳腺癌）,防治骨質疏松、改善更年期綜合癥等作用[2],具有較高的藥用價值。岷山紅三葉作為甘肅省具有地域特點的優良豆科牧草和藥用植物,不僅產量高、品質優,且富含異黃酮,經甘肅省草原技術推廣總站化驗室檢測,岷山紅三葉中異黃酮含量為1.0%～2.6%,是大豆異黃酮（0.1%～0.3%）的近10倍[3],同時由于其傳統自然的生產方式,不存在轉基因問題和除草劑、殺蟲劑等污染,符合安全無公害生產的要求,存在巨大的藥用價值和綠色保健品開發潛力。

異黃酮作為豆科作物生長過程中形成的一類次生代謝產物,其含量受植物本身、溫度、肥力等許多因素的影響,如紫外線輻射、磷素缺乏、長期冷凍處理等都可有效刺激豆科作物異黃酮合成[4]。

接種專用根瘤菌是提高紫花苜蓿Medicago sativa等豆科牧草產量及品質最重要的方法之一。據統計,全球每年生物固氮量達1.75×108t,為世界工業氮肥產量的4.37倍[5],目前美國有80%的紫花苜蓿在種植之前進行根瘤菌接種,在加拿大和澳大利亞,紫花苜蓿接種根瘤菌技術已經被普遍接受[5]。接種根瘤菌將成為未來提高豆科牧草產量和品質,改善和提高土壤肥力的重要農藝措施。然而針對紅三葉等豆科牧草藥用價值開發,目前還沒人就根瘤菌及其接種方式對豆科牧草異黃酮含量的影響進行專題研究。

試驗采用L9（34）正交設計,立足岷山生態氣候和土壤條件,研究不同根瘤菌梯度、接種方式和氮肥梯度對岷山紅三葉異黃酮含量及單位面積產量的影響,對指導甘肅省藥用紅三葉生產具有重要的生產指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況試驗在甘肅省定西南部特優牧草種子基地（岷縣奔直寺,34°17′N,104°02′E）進行,該基地海拔2 492 m,年平均氣溫5.7℃,年均降水量600 mm,無霜期112 d,年均日照時數2 229.6 h,≥10℃年有效積溫1 771℃·d。土質為亞高山草甸土,有機質含量為1.43%,總氮0.2%,速效磷12 mg/kg,pH值6.7,適宜種植紅三葉、貓尾草Phleum pratense等優良牧草。

1.2 試驗材料試驗用牧草品種選用岷山紅三葉（Mingshan）。氮肥為尿素（蘭州化工廠生產）。接種根瘤菌由北京森迪科技產品開發公司提供（每克含菌量200億）。

1.3試驗設計與方法采用L9（34）正交試驗設計,進行根瘤菌梯度（A）、接種方式（B）和氮肥梯度（C）三因素,在3個不同水平的組合,對岷山紅三葉異黃酮含量和單位面積異黃酮產量的影響,試驗共設9個處理,每個處理各設2個重復,共18個小區（表1）。另設一列D為空列,未安排試驗因素,其作用是反映試驗誤差。小區面積3.0 m×4.0 m。

施氮處理：由于當地土壤有機質和氮素含量較高,土壤比較肥沃,播種前試驗地均未施氮肥,播種時,尿素一次性施于小區土表后耙地,耬耙深度2～3 cm。

根瘤菌處理：1）播種時將根瘤菌施于土表后耙地；2）播種時將根瘤菌稀釋2倍,和種子拌勻,開溝撒播后覆土；3）深2 cm處施入根瘤菌后播種。

表1 L9（34）正交設計表

1.4 播種及田間管理2007年5月16日播種,行距40 cm,條播,播種量 18 kg/hm2,常規田間管理。

1.5 異黃酮含量和單位面積異黃酮產量的測定2008年7月20日,采集盛花期岷山紅三葉的植物地上部分,干燥箱烘干,粉碎,過40目網篩。采用紫外分光光度法[6-7],在波長260 nm處對岷山紅三葉異黃酮含量進行測定。

盛花期每小區隨機選取1 m×1 m樣方刈割,自然風干,稱取風干質量,換算成單位面積產量（kg/hm2）。利用盛花期單位面積岷山紅三葉產量及該時期各處理異黃酮含量計算單位面積異黃酮產量。

1.6 數據處理應用SPSS軟件（13.0版）進行正交試驗方差分析。

2 結果與分析

2.1 直觀分析L9（34）正交試驗測定結果見表2。由表 2直觀分析可知,RA（1.34）＞RC（1.08）＞RB（0.89）＞RD（0.52）,說明 A 、B、C三因素對指標的影響是確定的,且A因素是影響異黃酮含量和產量的主要因素,其次為C因素。

2.2 異黃酮含量分析各處理方差分析結果見表3。分析結果顯示,A因素（根瘤菌梯度）對岷山紅三葉異黃酮含量存在顯著影響（P＜0.05）,以A2（16 g/kg）水平組最高,A2顯著高于A1（0）和A3（32 g/kg）水平組,分別較A1和A3水平高29.1%和33%,A2和A3之間差異不顯著（P＞0.05）,說明在岷山紅三葉生產中,接種適宜數量（16 g/kg）的根瘤菌對提高岷山紅三葉異黃酮含量具有一定的作用；接種方式對岷山紅三葉異黃酮含量的影響差異不顯著,但具有依表施（B1）、拌種（B2）、深 2 cm處施入（B3）根瘤菌的次序增加的趨勢,以深2 cm處施入根瘤菌效果較好；氮肥對岷山紅三葉異黃酮含量也不存在顯著影響,與 C1（0）組相比,C2（42 kg/hm2）組具有降低的趨勢,而C3（84 kg/hm2）組異黃酮含量與C1相近。

2.3 單位面積異黃酮產量分析各處理單位面積異黃酮產量分析結果見表3。

表2 正交試驗測定結果

表3 不同處理方式各生產指標方差分析結果表

試驗結果表明：接種根瘤菌對岷山紅三葉單位面積異黃酮產量有顯著影響（P＜0.05）,以A2水平組最高,A1水平組最低,A2顯著高于A1水平組 ,較 A1高 53.02%,較 A3高 22.94%,而 A3與A1和A2之間差異均不顯著；接種方式、氮肥施用量對岷山紅三葉單位面積異黃酮產量無顯著影響,其中B2和B3組單位面積異黃酮產量相近,較B1組高 。

2.4 最優水平組合選擇以上分析結果表明：接種根瘤菌對岷山紅三葉異黃酮含量和單位面積產量均存在顯著影響（P＜0.05）,并且都在A2（16 g/kg）水平組異黃酮含量和單位面積產量最高；雖深2 cm處施入根瘤菌異黃酮含量較高,但拌種方式可獲得較高的單位面積異黃酮產量,且施用時操作比較方便；在不施氮肥的情況下均能獲得較高的異黃酮含量和產量。因此綜合考慮根瘤菌梯度、接種方式和氮肥梯度對岷山紅三葉異黃酮含量和產量的影響,在岷縣自然生態和土壤條件下,以每千克岷山紅三葉種子與16 g根瘤菌肥料種,不施氮肥效果較優。

3 討論

根瘤菌是豆科植物根系上生長的細菌,與豆科植物具有特殊的互利共生關系,宿主為根瘤菌提供良好的居住環境、碳源和能源以及其他必需營養,而根瘤菌則為宿主提供氮素營養。目前豆科牧草與其相應的根瘤菌共生固氮的研究已在紫花苜蓿、紅豆草Onobrychris vicaefolia和紅三葉等牧草上取得了進展,肯定接種根瘤菌可提高豆科作物的根瘤數和結瘤率（尤其在牧草生長早期）,具有提高豆科牧草產量、改善其營養成分和品質的作用,并能改善和提高土壤肥力[8-11]。然而就根瘤菌及其接種方式對紅三葉等豆科牧草異黃酮含量影響的研究目前尚未見報道。該試驗結果顯示,根瘤菌梯度對岷山紅三葉異黃酮含量和單位面積異黃酮產量存在顯著影響（P＜0.05）,接種適宜數量（16 g/kg）的根瘤菌對提高岷山紅三葉異黃酮含量和產量具有一定的作用。

McMurray等[12]報道,當紅三葉缺磷時,芒柄花素含量比施肥處理（23和96 kg/hm2）高；也有試驗表明,施氮、磷、鉀肥均具有降低豆科牧草中異黃酮含量的趨勢[13],不施氮肥或氮肥施用量為75 kg/hm2時,單位面積的異黃酮產量最高[14]。就本試驗而言,氮肥施用量為0～84 kg/hm2,與試驗所報道[13-14]的0～75 kg/hm2的施用量接近,未表現出明顯差異和規律,有必要在更大尺度上做進一步研究。

4 結論

4.1試驗結果表明,根瘤菌梯度（A）、接種方式（B）和氮肥梯度（C）對岷山紅三葉異黃酮含量和單位面積異黃酮產量影響大小的排列次序為A＞C＞B。接種根瘤菌對岷山紅三葉異黃酮含量和產量影響顯著（P＜0.05）,以每千克岷山紅三葉種子接種16 g根瘤菌效果較好。

4.2接種方式和氮肥梯度對岷山紅三葉異黃酮含量和產量不存在顯著影響,根瘤菌拌種和不施氮肥均能獲得較高的異黃酮含量和產量。

4.3綜合考慮根瘤菌梯度、接種方式和氮肥梯度對岷山紅三葉異黃酮含量和產量的影響,在岷縣生態氣候和土壤條件下,藥用岷山紅三葉生產以每千克岷山紅三葉種子施用16 g根瘤菌,拌種,不施氮肥的組合最優。

[1]江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上海科學技術出版社,1975：1012-1013.

[2]Peter H M,Ronald B.Isoflavones from red clover（Promensil）significantly reducemenopausal hot flush symptoms compared with placebo[J].Maturitas,2002,42：187-193.

[3]袁金斌,盧建中.紫外分光光度法測定大豆總異黃酮的含量[J].大豆科學,2004,23（2）：147-149.

[4]孫君明,韓粉霞.植物次生代謝產物異黃酮的調控機理[J].西南農業學報,2005,18（5）：663-667.

[5]席慶國,洪浩.外來植物奇崗的生物學特性[J].草業科學,2008,25（2）：25-28.

[6]谷文英,余飛,陳瑩,等.不同生長時期紅三葉異黃酮含量變化的研究[J].草原與草坪,2006（3）：61-64.

[7]陳封政,李書華,弓加文.紅三葉中總異黃酮含量的測定[J].樂山師范學院學報,2005,20（5）：49-50.

[8]黃新,王亞琴,劉建新,等.接種根瘤菌對不同紫花苜蓿品種結瘤和生物學產量的影響[J].浙江農業學報,2005,17（6）：391-394.

[9]喻文虎,楊鵬冀,賈德榮.紅豆草、紫花苜蓿根瘤菌接種研究[J].草業科學,1995,12（3）：22-25.

[10]曾昭海,隋新華,胡躍高,等.紫花苜蓿-根瘤菌高效共生體篩選及田間作用效果[J].草業學報,2004,13（5）：95-100.

[11]李富寬,翟桂玉,沈益新,等.施磷和接種根瘤菌對黃河三角洲紫花苜蓿生長及品質的影響[J].草業學報,2005,14（3）：87-93.

[12]McMurry C H,Laidlaw A S,McElroy M.The effect of plant development and environment on formononetin concentration in red clover[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,1986,37：333-340.

[13]朱占強.光強和施肥對紅車軸草生長、養分吸收及異黃酮含量的影響[D].長沙：湖南農業大學,2005.

[14]岳燕.不同生境和施肥量對岷山紅三葉草產量及異黃酮含量影響的研究[D].蘭州：甘肅農業大學,2007.