白三葉×高加索三葉草F1代莖段離體培養器官發生的研究

黃 帆,王明玖,何麗君,陳麗麗

（1.內蒙古農業大學生態環境學院,內蒙古呼和浩特 010019；2.內蒙古農業大學農學院,內蒙古呼和浩特 010019）

①豆科牧草是草地的重要組成部分,是家畜主要蛋白質飼料的來源[1]。豆科牧草多數具備產量高、品質好、易于栽培的特點,是飼料牧草領域研究較多且較廣的科、屬之一[2]。三葉草屬Tri folium植物,屬一年生或多年生草本,是一種優良的豆科牧草。高加索三葉草是內蒙古農業大學生態環境學院從國外引進的一個優良草種。經過多年的連續試驗觀察,對其生物學、生理學、遺傳學等特性及生產性能和適應性有了系統認識,其草產量高,抗旱、抗寒能力很強[3-4],但其固氮能力很差。國內學者對白三葉T.repens研究較多,其產量高,根瘤固氮能力強,根系淺,喜濕、喜暖[5-11]。研究表明,高加索三葉草T.ambiguum與白三葉是具有親緣關系的2個種[12],為了結合2種三葉草的優點,克服各自的不足,已利用遠緣雜交和胚培養技術得到雜交F1代[13]。試驗以雜交F1代的莖段作為外植體,通過組織培養的直接器官發生方式建立擴繁體系,為進一步回交恢復后代育性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況高加索三葉草從新西蘭引進,供試材料為在內蒙古農業大學試驗田內栽培生長第7年的植株。白三葉為從大興安嶺采集、在內蒙古農業大學試驗田種植后的越冬植株。試驗田位于 40°49′N 、114°41′E,海拔1 063 m。該地為典型大陸性氣候,光照充足,年均降水量約400 mm；多年平均氣溫5.4℃,1月極端最低溫-32.8℃。初霜期多在9月下旬,晚霜期一般在5月中旬。田內土壤為砂質栗鈣土,pH值約7.5,土壤具有中等肥力,有灌溉條件。

試驗以高加索三葉草為母本,白三葉草為父本進行雜交后未成熟胚離體培養獲得的F1代無菌苗的莖段作為外植體,進行不定芽的誘導、分化及生根試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1不定芽的誘導 將F1代無菌苗的莖分別切成1 cm左右的小段接種在添加不同質量濃度2,4-D、6-BA、NAA的MS誘導培養基上,其中蔗糖2%,瓊脂0.75%,培養基的pH 值為6.0。每瓶培養基中接種5個莖段,每種培養基各接種20瓶。接種完畢后將其放在實驗室內培養,每日光照10～12 h,光照強度為 18 000～22 000 μ mol/（m2·s）,室內溫度保持在27℃左右。

1.2.2不定芽的分化培養 培養4周后將誘導直接產生的不定芽分別接種到添加不同質量濃度2,4-D、6-BA、NAA 、KT 的MS分化培養基上,其中蔗糖2%,瓊脂0.7%,培養基的pH值為6.0,每種培養基接種20瓶,并根據不同的激素配比將培養基分為Q系列、R系列和T系列。之后每隔30～35 d繼代一次,并統計分化率。

分化率=不定芽分化的塊數/接種的總塊數

1.2.3根的誘導 分化產生的不定芽長到3.0～4.0 cm時,將其分別接入添加不同質量濃度NAA、IBA的MS培養基以及不添加任何激素的1/2MS、MS培養基上誘導生根,其中蔗糖1.5%,瓊脂0.75%,培養基的pH值為6.0。定期觀察生根情況,篩選最適合的生根培養基。

1.2.4完整植株的形成與移栽 將生根后形成的小植株在培養室內進行煉苗,3～5 d后待培養基表面開始染菌時,沖洗根部的培養基,栽種于高溫滅菌后的珍珠巖∶沙土=1∶1（體積比）的基質中,每日觀察其生長狀況。

2 結果與分析

2.1 不定芽的誘導將雜種F1代無菌苗的莖段接種在編號為D1～D11的MS誘導培養基上（圖1）。接種1周左右莖段的兩端開始膨大。20 d后部分外植體愈傷化,產生的愈傷組織為淡綠色,結構緊密；部分外植體直接分化產生不定芽。不同激素組合的MS培養基對雜交F1代莖段不定芽的誘導有不同的影響,11種培養基中只在D4和D8培養基中有器官發生現象（圖2）,這2種培養基中6-BA的質量濃度相同。另外,隨著2,4-D質量濃度的增加,產生的不定芽也增加,但D8培養基中同時伴隨較高的褐化率。可見2,4-D質量濃度是誘導 F1代莖段不定芽的關鍵因素。最終選擇添加2,4-D 0.1 mg/L、6-BA 2 mg/L的D4培養基為不定芽誘導培養基,進行試驗。

圖1 雜交F1代無菌苗莖段不定芽誘導培養基

2.2 不定芽的分化培養約30 d后,將誘導形成的不定芽分別接種在編號為Q1～Q10,R1～R14,T1～T7的培養基中進行分化培養并統計分化率（表1）。大約經歷40 d部分不定芽逐漸伸長形成莖和葉（圖3）,部分則褐化死亡。由表1可以看出不同激素類型及不同質量濃度配比的培養基對不定芽的分化影響。分化率最高的為T系列培養基,整體分化率都在80%以上,相比之下,R系列培養基整體分化率較低,只有 R8、R9、R13、R14分化率在70%以上,而Q系列培養基分化率居中。Q系列培養基中,在6-BA含量不變的情況下,通過對生長素2,4-D進行梯度添加,來篩選適宜的分化培養基,發現添加2,4-D 0.04 mg/L、6-BA 2 mg/L的Q4培養基的分化率最高。R系列培養基中,將 R1～R7與R8～R14對比可以發現,降低培養基中6-BA的含量利于不定芽的分化 ,添加 0.5、0.75、1.0 mg/L NAA 的培養基分化率較低,而添加低于0.5 mg/L NAA和高于1.0 mg/L NAA的培養基分化率相對較高。T系列培養基（圖4）在R系列培養基的基礎上添加了1.0 mg/L的 KT,整體的分化率均為80%以上,KT對F1代莖段不定芽的分化過程影響較大（表1）。

圖2 誘導形成不定芽

圖3 不定芽逐漸伸長

圖4 分化形成的小植株

表1 不同質量濃度激素配比培養基對不定芽分化的影響

2.3 不同培養基對生根的影響將分化形成的植株叢分別接入10種不同激素配比的生根培養基中（表2）,定期觀察生根情況。結果發現植株叢在G1、G2培養基中不生根；在G3、G7以及G8培養基中生根速度慢且根系不夠發達；在G4、G5以及G6培養基中生成的根粗,但生根速度慢；在1/2MS培養基中生根效果最佳,根系較發達（圖5）。由表2可以看出,添加了激素的培養基中,生根速度較不添加任何激素的慢；植株叢在同時添加了NAA和IBA兩種激素的培養基中生根較粗,但是生根速度較慢；在單獨添加NAA或IBA的培養基中生根速度慢且根系不發達；1/2 MS培養基較MS培養基生根效果更佳,最終選用1/2MS培養基作為生根培養基。

圖5 1/2MS培養基生根效果

表2 不同濃度激素配比培養基對不定芽生根的影響

2.4 植株的馴化與移栽組織培養苗是在溫度恒定和高度濕潤的條件下生長的,主要的代謝方式為異養。由于組織培養苗的特殊生活環境,使它的外部特征和生理特性與大田里的植株有明顯差別[14]。在煉苗的過程中應盡量保持濕度和避免強光輻射,避免組織培養苗葉片氣孔過多的蒸騰。在試驗中,為了使F1組織培養苗能較快適應移栽后的溫度、光照和有菌環境,移栽后于苗的周圍蓋上一層薄膜來控制濕度,同時放在弱光的地方。在溫室內培養1周左右,去掉薄膜,然后將其放到陽光充足的地方繼續培養。有新葉長出代表小苗移栽成功,試驗按以上方法移栽,其成活率可達80%以上。

3 討論

在植物組織培養中,植株再生可通過不定芽或體細胞胚胎發生等途徑實現[15-16]。不定芽可以從外植體脫分化形成的愈傷組織中發生,屬間接器官發生途徑；也可以不經過愈傷組織直接從外植體上分化形成,屬直接器官發生途徑[17]。通過適合的培養條件和激素配比的誘導,同一植物中體細胞胚胎發生和器官發生有可能會同時出現。據不完全統計,在至今報道的上千種形成再生植株的植物中,兼具這2條途徑的植物僅有幾十種,例如槐樹Sophora japonica植株再生兼具這2種途徑[18],胡鳳榮等[19]研究東方百合Lilium oriental的愈傷組織在MS培養基中添加2,4-D時進行暗培養,也可同時誘導出不定芽和體細胞胚胎。

培養基中植物生長調節劑組合及濃度直接影響體細胞愈傷組織及器官發生與否及其生長情況。本試驗采用直接器官發生方式,以F1代莖段作為外植體,直接誘導出了大量不定芽。器官直接發生方式與間接發生方式相比,其優勢在于縮短了從外植體到獲得完整植株的周期,降低了組培成本,同時這一途徑的變異頻率相對較低,確保了克隆的再生植物的遺傳穩定性[20]。

組織培養苗需經過從無菌環境到有菌環境的轉變,保持濕度和避免強光輻射是煉苗過程中特別需要注意的問題,這對于苗的最終成活起著非常重要的作用,同時成活率的高低與它們在培養基中長出的不定根有直接的關系,許多學者也都注意到了這些問題[21-25]。本研究試管苗移栽成活率在80%以上,為進一步研究打下堅實的基礎。

4 結論

試驗以雜種 F1的莖段為外植體,篩選出MS+2,4-D 0.1 mg/L、6-BA 2 mg/L為適宜的誘導不定芽培養基。繼代后將誘導形成的不定芽分別接入添加不同配比2,4-D、6-BA、KT、NAA的培養基中,最終得到MS+NAA0.5 mg/L、6-BA 1 mg/L、KT 1 mg/L為分化率最高的培養基。對生根培養基的選擇中,發現不添加任何激素的1/2MS培養基為最佳的生根培養基。通過直接器官發生的途徑建立起雜種F1代擴繁體系,為恢復F1代的育性和加快回交速率做好了準備。

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