表達序列標簽的應用現狀及分析方法研究

（北京林業大學草地資源與生態實驗室,北京 100083）

①表達序列標簽 EST（Expressed Sequence Tag）是從一個隨機選擇的cDNA克隆進行5'端和3'端單一次測序獲得的短的cDNA部分序列,代表一個完整基因的一小部分,在數據庫中其長度一般從20～7 000 bp不等,平均長度為360±120 bp。EST作為表達基因所在區域的分子標簽因編碼DNA序列高度保守而具有自身的特殊性質,與來自非表達序列的標記（如 AFLP、RAPD、SSR等）相比更可能穿越家系與種的限制,因此EST標記在親緣關系較遠的物種間比較基因組連鎖圖和比較質量性狀信息上是特別有用的。另外,由于EST來源于一定環境下一個組織總mRNA所構建的cDNA文庫,因此EST也能說明該組織中各基因的表達水平。ESTs已經被廣泛地應用于基因識別,研究發現ESTs的數目比GenBank中其他的核苷酸序列多,研究人員更容易在EST庫中搜尋到新的基因[1]。由于EST測序只是測定部分序列,也不需要對克隆進行排序,因而完成EST測定所需要的人力、物力消耗與基因組測序和全長cDNA測序相比要少的多,具有經濟和高效的特點。由于DNA測序技術的不斷更新和大規模測序技術的出現,在DNA測序中逐步實現了工廠化和流水作業,因此測序費用大幅度降低[2]。

近年來,表達序列標簽數據增長迅速。在GenBank102版本數據中,EST序列已經占用了2/3的記錄[3]。美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）對EST進行了聚類分析,按基因劃分EST,組成UniGene數據庫。還有一些網站開發了基于Internet的EST延伸服務,如Labonweb網站的IRACE（http：//www.labonweb.com）,Biosino網站的BioEclone（http：//bioinfo.bosino.org：9090/bioeclone.html）等[4-5]。

因此對EST的技術要求及應用進行歸納分析,有利于對研究對象分析不同基因的表達水平,為挖掘和克隆基因提供理論支撐。

1 EST特點及其應用

EST計劃作為植物基因組計劃的一個重要組成部分,已經在多種植物物種中開展起來。相關標記包括 EST-SSR、EST-PCR、EST-SNP、EST-AFLP、EST-RFLP等[6]。近年來,EST的應用已經深入到生物學的領域,其中表達序列標簽微衛星（EST-SSR）技術的發展和應用較為普遍,根據SSR的來源可將其分為基因組SSR和EST-SSR[7]。EST-SSR標記狹義上是指位于EST序列上的或者基于EST序列開發的SSR標記,也被稱為eSSR標記。

目前較為常用的核酸序列數據庫有：美國國家信息中心的GenBank,歐洲分子生物學實驗室的EMBL,日本國家數據庫DDBJ,這3個數據庫是收錄范圍最廣并完全向公眾開放的數據庫,在它們中均含有EST子數據庫dbEST。在核酸序列數據庫中,EST的量要占65%以上[8]。

由于EST是功能基因的一部分,不同基因組間,基因編碼區序列的保守性遠遠高于非編碼區,與基因組SSR相比EST-SSR表現出較好的物種之間的可轉移性[9-10]。作為一種新型分子標記,EST-SSR來自表達基因,因而除具備傳統基因組來源的SSR標記的所有優勢外,可能與基因功能表達具有直接或間接關系,從而強化了SSR標記在遺傳研究中的應用[11]。

在種質資源遺傳多樣性方面,張鵬等[12]利用SRAP和EST-SSR分子標記對192份國內外芝麻Sesamum indicum進行分析。發現我國南部地區芝麻品種遺傳多樣性較中部和北部地區豐富。Eujayl等[13]利用EST-SSR等3種不同類型的微衛星標記對64個硬粒小麥Triticum aestivum品種的遺傳多樣性進行評價,表明EST-SSR可在硬粒小麥中揭示較高的多態性。

在基因連鎖方面,利用分群分析法對多花黑麥草Lolium perenne抗葉斑病進行EST-CAPS標記,得到位點p56位于第5遺傳連鎖群,所處的基因為編碼多花黑麥草天冬酰胺合成酶基因[14]。

在基因功能方面,郭久峰等建立沙冬青Ammopiptan thus mongolicus的cDNA文庫并通過EST分析技術研究其抗逆機理,得到的313個已知功能的基因標簽中抗逆相關的有48條[15]。

楊成君等[16]建立了藥用植物人參Panax qinseng的EST-SSR標記。陳士林等[17]構建了西洋參P.quinquefolius的cDNA文庫,經EST分析獲得與水分脅迫相關的基因7個,與受傷誘導相關的基因2個,編碼抗氧化酶相關的基因6個。并在根系的EST文庫中發現抗病基因12個,62個 EST是其他物種尚未報道的新基因。佘瑋等[18]以生長中期的苧麻Boehmeria nivea莖皮為材料構建cDNA文庫,并進行EST分析,隨即測序得到275個有效序列,約53.5%的 EST序列可能是未報道的新基因序列。

綜上所述,EST為種質資源的保護利用和遺傳育種工作提供科學依據,同時作為功能基因組研究的重要手段,在功能基因的開發與研究中也發揮重要作用。

2 EST在苜蓿中的研究

近幾年,苜蓿Medicago sativa分子水平的研究有所深入,利用RAPD分子標記研究苜蓿種質資源遺傳多樣性[19]及其他相關基因的克隆序列分析等研究相對較多,如蒺蒺藜狀苜蓿中MtERF-6基因的克隆及序列分析[20]。但EST的研究相對較少,閆娟等[21]利用EST-SSR標記分析了我國北部和中部地區天藍苜蓿M.lupulina的遺傳多樣性和遺傳結構,推測中等水平的遺傳多樣性和高度的居群間遺傳分化主要受它的自交特性和分布方式影響。

在Genbank數據庫中進行搜索,得出測序最多的 20個物種中,除經濟類作物玉米Zea mays、水稻Oryza sativa、小麥等序列較多外,大部分物種為動物,蒺藜狀苜蓿排在最后,序列條數為409 757。在表達序列標簽數據庫（dbEST）中進行搜索,測序最多的前20個物種中,沒有和苜蓿相關的物種序列（總序列45 660 524條）。由以上數據可以看出,苜?；虻臏y序分析研究相對較少,只有蒺藜狀苜蓿得到的EST較多,而紫花苜蓿和黃花苜蓿M.f alcata有待深入的研究。

3 EST獲取及分析過程

3.1EST的獲取過程構建生物某一發育階段的cDNA文庫,然后大規模、隨機地挑選cDNA文庫中的克隆或通過某種方法篩選cDNA中的某些克隆,最后對cDNA克隆的5'及3'進行測序,進而得到一個EST[22]。

3.2EST分析過程

3.2.1利用ESTs大規模分析基因表達水平 一般認為,組織和細胞分化依賴于基因特異性的時空表達,而生物體在某一時期的基因表達數量通常只占全部基因的15%[23]。

因為EST序列是從某種特定組織的cDNA文庫中隨機測序而得到的,所以可以利用未經標準化和差減雜交的cDNA文庫EST分析特定組織的基因表達譜。標準化的cDNA文庫和經過差減雜交的cDNA文庫則不能反應基因表達的水平。

為研究癌癥的分子機理,美國國家癌癥研究所NCI的癌癥基因組解析計劃（Cancer Genome Anatomy Project,CGAP）構建了很多正常的或是癌癥前期的和癌癥后期的組織的cDNA文庫,并進行了大規模的EST測序,其中大部分的文庫未經標準化或差減雜交處理。CGAP網站提供了多種工具用以分析不同文庫間基因表達的差異,如：Digital Gene Expression Displayer（DGED）和cDNA xProfiler。

3.2.2基因表達系列分析（Serial Analysis of Gene Expression,SAGE） 隨著公用數據庫中EST數據的急劇增加,基因表達研究可以利用數字化分析方法來實現[24-25],即從能夠代表相應組織或器官基因表達情況的cDNA文庫中獲得大量EST,經過軟件聚類拼接后依據代表基因的EST及其出現頻率的信息進行基因表達分析。同樣原理,也可以利用代表基因3'端表達信息的SAGE標簽或近來出現的代表基因5'端信息的CAGE標簽來進行。有學者把這種基于表達標簽的基因表達水平定量分析方法稱為數字化方法（digital method）或者數字化 Northern（digital Northern）,而將傳統的與cDNA克隆陣列和Oligo芯片雜交分析稱為模擬方法（analog method）[26]。

Velculescu等[27]1995年提出基因表達系列分析是一種用于定量、高通量基因表達分析的實驗方法。SAGE的原理就是分離每個轉錄本的特定位置的較短的單一的序列標簽（約9～14個堿基對）,這些短的序列被連接、克隆和測序,特定的序列標簽的出現次數就反映了對應的基因的表達豐度。技術流程如圖1。

3.2.3DNA微陣列或基因芯片的研究 隨著ESTs數據的擴大,用ESTs文庫制備的DNA芯片將使測序過程簡化并有力促進功能基因組學研究[28]。

高密度寡核苷酸cDNA芯片或cDNA微陣列是一種新的大規模檢測基因表達的技術,具有高通量分析的優點。在許多情況下,cDNA芯片的探針來源于3′EST[29],所以EST序列的分析有助于芯片探針的設計。以上幾種方法比較,ESTs更適合大規模分析基因的表達水平（表 1）。

4 ESTS與基因預測

Adams等[30]提出的表達序列標簽的概念標志著大規模cDNA測序時代的到來。雖然EST s序列數據相對不精確,精確度最高為97%[31],但實踐證明EST技術可大大加速新基因的發現與研究。

由于EST來源于 cDNA,因此每一條 EST均代表了文庫建立時所采樣品特定發育時期和生理狀態下的一個基因的部分序列。使用合適的比對參數,90%以上已經注釋的基因都能在EST庫中檢測到[32]。ESTs可以作為其他基因預測算法的補充,因為它們對預測基因的交替剪切和3'非翻譯區很有效。

4.1 測序方向的選擇根據不同的試驗目的選擇不同的測序方向[33-34]：

1）5'端：5'端上游非翻譯區較短且含有較多的調控信息。一般在尋找新基因或研究基因差異表達時用5'端EST較好,大部分EST計劃都是選用5'端進行測序的,而且從5'端測序有利于將EST拼接成較長的基因序列。

2）3'端：3'端mRNA有一 20～200 bp的plyA結構,同時靠近plyA又有特異性的非編碼區,所以從3'端測得EST含有編碼的信息較少。但研究也表明[35],10%的mRNA 3'端有重復序列,這可以作為SSR標記；非編碼區有品種的特異性,可以作為STS標記。

圖1 SAGE技術流程

表1 幾種大規模分析基因表達水平的方法比較

3）兩端測序：獲得更全面的信息。

4.2 序列前處理由于得到的序列包含一些不利因素,再聚類前要經過處理。主要涉及到：1）去除低質量的序列（Phred）；2）應用BLAST、RepeatMasker或Crossmatch遮蔽數據組中不屬于表達的基因的贗象序列（artifactual sequences）,包括：載體序列（ftp：//ncbi.nlm.nih.gov/reposi-tory/vector）、重復序列（RepBa,http：//www.girinst.org）和污染序列（如核糖體RNA、細菌或其他物種的基因組DNA等）；3）去除其中的鑲嵌克隆,鑲嵌克隆的識別包括Back-to-back poly（A）+tails、Linker-to-linker in middle of the sequence和Blastn/Blastx search；4）最后去除長度小于100 bp的序列。

4.3 聚類方法及ESTs聚類的數據庫分析比較EST聚類（clustering）分析通過序列同源比較或其他注釋信息,把屬于同一基因的EST聚合成一簇,聚類的作用就是為了產生較長的一致性序列（consensus sequence）,用于注釋。降低數據的冗余,糾正錯誤數據可以用于檢測選擇性剪切[36]。

4.3.1聚類可分為不嚴格的和嚴格的聚類（loose and stringent clustering） loose clustering特點：產生的一致性序列比較長,含有同一基因不同的轉錄形式,如各種選擇性剪接體。每一類中可能包含旁系同源基因（paralogous expressed gene）的轉錄本,序列的保真度低。如南非國家生物信息研究所（SANBI）的STACK[37]采用基于字的聚類算法（word-based clustering）,省略了所有的比對過程,其核心在于識別并計算序列間有多少長度為n的字（word）能夠匹配,代表性的算法有d2_cluster算法[38],是一種凝聚性的聚類算法。

而stringent clustering則產生的一致性序列比較短,表達基因ESTs數據的覆蓋率低,因此所含有的同一基因的不同轉錄形式少,序列保真度高。它采用類似于BLAST和FASTA的序列比對的算法,通過尋找序列間的局部相似性來判斷兩序列是否具有重疊片段或連續的匹配,并據此聚類。如NCBI的Unigene[39]（此系統同時還利用一些注釋信息,如EST序列的克隆號）以及美國基因組研究所（TIGR）的 Gene Indices[40]（TGICL聚類,適用于大規模EST序列的快速聚類,并可進行連鎖分析）。

4.3.2ESTs聚類的主要數據庫

1）UniGene（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene）：UniGene Clustering方法由美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）發展而來。該方法使用MEGABLAST程序[41]對序列進行同源比較,采用的聚類閾值為序列間至少有100個堿基的重疊區,并且占70%以上的重疊區域的堿基同源性大于96%,依據該閾值先對已注釋的基因聚類成簇,再根據EST與EST及EST與初始基因簇之間的序列同源性進一步進行聚類,由此產生的基因簇包括同一基因的不同剪接形式。

2）TIGR Gene Indices（http：//www.tigr.org/tdb/tgi/）：目前,根據不同的研究目的發展了多種EST聚類分析方法,其中被廣泛使用的有美國基因組研究所發展而來的TIGR-ASSEMBLER方法[42]。該方法借助FASTA程序[43]對序列進行兩兩比較,再根據同源比較結果用 TIGR-ASSEMBLER工具對相關序列進行拼接,把重疊區超過40個堿基,且該區域的堿基同源性大于95%的序列合并成一簇。TIGR利用這個方法對來源21個物種的5 358 611條EST進行了聚類分析,分別建立了各個物種的基因索引（TIGR Gene Indices）[44]。

3）STACK：南非國家生物信息研究院（South African National Bioinformatics Institute,SANBI）的STACK-PACK方法（http：//www.sanbi.ac.Za/Dbases.html）,其主要特點是根據不同的組織來源先把EST分類,再根據重疊區超過150個堿基,且重疊區域的堿基同源性大于96%的聚類閾值,用d2-cluster程序[45]對各類EST分別聚類。用STACK-PACK分析結果建立的STACK數據庫可用來進行SNPs檢測和基因特異性表達的研究[46]。

目前有學者已經提出了一種基于樣本間關系的新聚類方法,即從基因表達數據中通過pearson相關系數獲得樣本間的關系,并用網絡的方法表示這種關系,通過該網絡的空間結構特征來提取樣本間的關系特征,并在這種關系特征空間中進行樣本的聚類[47]。

4.3.3基于BLAST和FASTA的腳本（BLASTN and FASTA-based scripts） 在 EST研究中,使用最多的方法就是序列相似性比較,以此來確定EST的功能。BLAST（Basic Local A-lignment Search Tool）是應用較廣的工具軟件之一,為同源分析的軟件包,包括 BLASTN、BLASTP 、TBLASTN 、TBLASTX 、BLASTX 5 個軟件[48]。

4.3.43個數據庫的比較分析

1）UniGene：結合有指導的和無指導的方法,而且在聚類過程中使用了不同水平的嚴格度,聚類的算法為megablast,數據庫不產生一致性序列。

2）TIGRGene Index：用的是有嚴格的和有指導的聚類方法,聚類的算法為類似于BLAST和FASTA的FLAST,該法得到的一致性序列較短,交替剪切得到的不同的基因屬于不同的索引。

3）STACK：用不嚴格的和無指導的聚類方法,聚類的算法為d2_cluster,產生較長的一致性序列,同一索引中含有不同的剪切方法得到的基因。

4.4EST接拼由于高中比率重復序列的存在、克隆文庫時產生的無可回避的間隙、基因的多態性以及測序技術或實驗室一些人為因素引起的錯誤等的存在,要想把序列拼接正確是非常困難的[49]。Cluster的連接：利用cDNA克隆的信息和5',3'端Reads的信息,不同的Cluster可以連接在一起。常用的拼接軟件為Phrap。Phrap常與phred、cross-match、consed組成一個軟件包,通常用的是 perl寫的腳本程序 PhredPhrap。Feng Liang 等比較了 Phrap、CAP3、T IGR Assembler,認為CAP3是最佳的軟件[50-51]。

4.5 基因注釋及功能分類注釋的過程包括序列比對尋找同源基因和蛋白結構功能域的搜索。

4.5.1注釋 EST數據注釋通常先做blastx比對,將所有未知的EST序列按理論上的6種閱讀框翻譯為蛋白質序列,在非冗余的蛋白序列數據庫（Non-redundantprotein Sequence Database,NR）中搜索同源序列,它提供所有可能的翻譯結果的比對,并且對每個比對結果進行綜合的顯著性分析。在blastx中不能匹配上的核酸序列可以繼續通過blastn搜索相應的核苷酸序列數據庫（Nucleotide Sequence Database,NT）。如果要進一步驗證BLAST結果,或者更詳細了解蛋白序列信息,可以通過InterPro來補充和完善。同樣通過BLAST無法注釋的序列,可以進一步通過InterPro數據庫,搜索序列中可能含有的蛋白功能結構域（domain）、模體（motif）等信息[52]。

局部序列比對工具BLAST是最常用的相似性檢索工具[53-54]。用戶可以登錄NCBI網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行檢索,也可在其他網站上進行檢索,還可以下載于本地運行（ffp：//ftp.ncbi.nih.gov/）。

4.5.2基因功能分類 基因功能的分類可分為手工分類和計算機批量處理。

其中手工分類的大部分以Adams等[55]提出的分類體系為標準。而計算機批量處理則是利用標準基因詞匯體系Gene Ontology進行近似的分類。其結果將會發現與已知功能的蛋白具有高度同源性的已知基因（known genes）,與未知功能的蛋白具有高度同源性的未知功能基因（unknown genes）和僅有很低同源性或沒有同源蛋白的序列,記為新基因（novel genes）[56]。GO注釋分為3個層次,分別說明基因產物執行哪種分子功能、參與哪個生理過程以及定位于哪個細胞部位[57]。

4.6 后續分析EST方法的優點在于它不需要很多關于目的基因的假設,可為后續的研究提供大量基因資源信息[58]。

所謂后續分析即EST通過以上聚類接拼,將基因功能分類后,進行比較基因組學分析、基因表達譜分析、新基因研究、基因可變剪切分析、實驗驗證（MicroArray、GeneChip、RTPCR、Northen bloting）[59]。

用EST取代對cDNA全長的篩選、基因組序列的鑒定等繁瑣的實驗操作,可大大地提高分離基因的效率。將所獲EST用生物信息學方法與各公共數據庫中已知序列進行比較,可迅速而準確地確定基因功能。由于在構建cDNA文庫時要盡可能地選用全長cDNA,所以一旦發現有價值的EST,就可以找到對應的克隆,獲得的全長cDNA可以直接用于如轉基因等的研究。

5 EST的問題與展望

用于構建的普通cDNA文庫進行測序時,由于EST測序時克隆的挑選是隨機的,高峰度表達基因引起mRNA的表達水平高而被反復測序；相反,一些峰度較低的基因需要測定上萬個克隆才有可能被挑選測序。因此,對于為尋找新基因或研究基因差異表達而言,用這樣的cDNA文庫進行測序,一方面稀有基因容易遺漏,及EST很短,沒有給出完整的表達序列,相對較低豐度表達基因不易獲得[60]。另外,由于只是一輪測序結果,出錯率達2%～5%。有時有載體序列和核外mRNA來源的cDNA污染或是基因DNA的污染會對實驗造成一定影響。鑲嵌克隆的出現以及序列的冗余都會導致所需要處理的數據量很大。

利用EST方法進行發現、分離基因的研究,不僅是人類基因組研究的熱點,而且是植物基因組研究的重要內容[61-62]。這將為人們更好地了解功能基因在不同組織中的表達提供分子生物學依據,從而為將來在分子水平調控生物的生長、發育、抗性和代謝規律打下理論基礎,提供極有價值的資源。

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