HPLC-CL聯(lián)用在線檢測消癌平注射液清除H2O2及O·－2自由基活性

朱 卉， 朱丹妮， 余伯陽

(中國藥科大學(xué)中藥復(fù)方教研室，江蘇南京211198)

消癌平注射液是由蘿藦科(Asclepiadaceae)牛奶菜屬植物通關(guān)藤(Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.)的干燥藤莖經(jīng)現(xiàn)代化工藝水提醇沉后制成，臨床用于治療原發(fā)性肝癌、食管癌和胃癌等惡性腫瘤，效果顯著［1］。腫瘤的發(fā)生與多種因素有關(guān)，自由基是其中重要的因素，自由基參與人體的癌變過程。氧自由基所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷刺激腫瘤的發(fā)生［2］。研究還發(fā)現(xiàn)許多腫瘤病人的癌細(xì)胞中氧自由基清除系統(tǒng)存在障礙［3］。消癌平注射液在臨床上治療多種腫瘤獲得良好的療效，但其抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制目前仍不明確。

化學(xué)發(fā)光分析法(CL)具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，與高效液相色譜(HPLC)的高效分離特性相結(jié)合，成為一種有效的痕量分析技術(shù)。近年來，高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光(HPLC-CL)聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速，已用于黃酮、合成除蟲菊脂、多酚、兒茶酚胺、芳香族化合物等的檢測［4-8］，還有文獻(xiàn)報(bào)道用于檢測藥物在體內(nèi)的分布、代謝情況［9-10］。

本試驗(yàn)將HPLC-CL聯(lián)用技術(shù)用于消癌平注射液，在線檢測其酚酸類物質(zhì)清除兩種氧自由基的活性，并利用HPLC-MS/MS分析技術(shù)鑒別其清除氧自由基的活性成分，為研究其抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型HPLC色譜儀(包括HP工作站、G1312A型二元泵、G1313A型全自動微量進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1314A型檢測器);Agilent 1100 LC/MSD Trap XCT ESI質(zhì)譜儀(Agilent Technologies，MA，USA)。

BPCL-1-G-C微弱發(fā)光測量儀及 BPCL Appl.7.2數(shù)據(jù)處理工作站(中國科學(xué)院北京生物物理研究所);十萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，上海，AE-240);PHS-25型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠);BT-200恒流泵(滬西分析儀器廠，上海)。

1.2 試藥

消癌平注射液(批號200903021，南京圣和藥業(yè)提供)，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號110753-200413)。

碳酸氫鈉和無水碳酸鈉(南京化學(xué)試劑廠，AR)，乙二胺四乙酸(EDTA)(上海化學(xué)試劑總廠，標(biāo)準(zhǔn)純)，3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾，luminol)(Fluka公司)。過氧化氫(30%)(南京化學(xué)試劑廠，AR)，連苯三酚(遵義第二化學(xué)廠，AR)，乙腈(美國TEDIA公司，色譜級)，磷酸(南京化學(xué)試劑廠，AR)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備

消癌平注射液，取適量過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18分析柱(250 mm ×4.6 mm I.D.5 μm)(Dikma Technologies)。流動相:0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫:0～15 min(B為2%～4%)，15～20 min(B 為4% ～7%)，20～35 min(B為7% ～10%)，35～35.01(B 為10% ～11%)，35.01～50 min(B 為11% ～11%)，50～75 min(B為11% ～18%)，75～100 min(B 為18% ～25%)，100～105 min(B為25% ～2%)。流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長300 nm。進(jìn)樣量:5 μL。

2.3 HPLC-MS/MS條件

HPLC分析條件:0.1%磷酸改用0.2%甲酸，其它條件同2.2項(xiàng)。

質(zhì)譜分析條件:負(fù)離子檢測模式;ESI離子源;掃描范圍:m/z 100-1200。毛細(xì)管電壓3500 V，干燥氣流速9.0 L/min，溫度350℃;霧化氣壓力40 psi。數(shù)據(jù)工作站為 LC/MSD Trap Software 4.2 and Data Analysis 2.2。

2.4 化學(xué)發(fā)光溶液的制備

碳酸緩沖液(pH 10.0 和11.0)0.1 mol/L 碳酸鈉水溶液和0.1 mol/L碳酸氫鈉水溶液按一定比例配成pH值為10.0和11.0緩沖液，分別加入 EDTA，使其濃度為6.3 ×10-3mol/L。

魯米諾貯備液 精密稱取一定量的魯米諾，用0.1 mmol/L的碳酸鈉水溶液配制成濃度為0.018 mol/L的魯米諾貯備液，避光，4℃保存，3天后使用。

連苯三酚貯備液精密稱取一定量的連苯三酚，用1mmol/L的鹽酸水溶液配制成濃度為0.01 mol/L的連苯三酚貯備液，避光，4℃保存。

清除過氧化氫溶液的制備 試劑Ⅰ(魯米諾溶液):精密量取魯米諾貯備液用碳酸緩沖液(pH 10.0)稀釋至濃度為 9.0 ×10-6mol/L。試劑Ⅱ(過氧化氫溶液):30%的過氧化氫溶液加水稀釋至濃度為8.8 ×10-7mol/L。

清除超氧陰離子溶液的制備 試劑Ⅰ(魯米諾溶液):精密量取魯米諾貯備液用碳酸緩沖液(pH 11.0)稀釋至濃度為 5.4×10-5mol/L。試劑Ⅱ(連苯三酚溶液):精密量取連苯三酚貯備液用水稀釋至濃度為1.51×10-5mol/L。

2.5 檢測裝置示意圖

HPLC-CL聯(lián)用系統(tǒng)是由高效液相和化學(xué)發(fā)光兩臺儀器串聯(lián)組成，主要包括HPLC(輸液泵、色譜柱、DAD檢測器)、混合器、化學(xué)發(fā)光檢測器(流通池、光電倍增管和記錄儀)及蠕動泵(輸送化學(xué)發(fā)光溶液)等主要組成部分。兩臺儀器連接主要由不同內(nèi)徑PEEK管和T型管連接(見圖1)。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC-CL條件的優(yōu)化

吸收波長的選擇:采用二極管陣列檢測器(DAD)掃描，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［11］，最終選擇300 nm為消癌平注射液的檢測波長，此波長下各色譜峰分離較好，干擾較小。

流動相的考察:HPLC-CL在線聯(lián)用方法，要求兩種儀器檢測條件及分析試劑的兼容性。相對于甲醇-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-醋酸洗脫系統(tǒng)，乙腈-磷酸洗脫系統(tǒng)具有較穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，磷酸濃度對化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度也有明顯影響［4，12-13］。試驗(yàn)最終確定使用0.1%磷酸-乙腈為洗脫系統(tǒng)。

圖1 HPLC-CL聯(lián)用系統(tǒng) P1-高壓泵 P2-蠕動泵 C-電腦 D-化學(xué)發(fā)光儀 TM-T型管 W-廢液 G-玻璃線圈Figure 1 HPLC-CL detection apparatus.P1-high pressure pump P2-peristaltic pump C-computer D-CL detector TM-mixing tee W-waste liquid G-glass coil.

化學(xué)發(fā)光溶液濃度和pH的確定:化學(xué)發(fā)光溶液的濃度和pH對于化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的穩(wěn)定和樣品活性成分的準(zhǔn)確定量至關(guān)重要［4，14］，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)增加緩沖液的pH值和魯米諾及連苯三酚的濃度能獲得較高化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，但要使產(chǎn)生的自由基能被活性成分快速清除，達(dá)到靈敏的檢測要求，必須有合適的試劑濃度和溶劑的pH值。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的前期實(shí)驗(yàn)，對緩沖液的pH值和魯米諾、過氧化氫、連苯三酚溶液的濃度分別進(jìn)行考察，最終確定使用pH值為10.0的緩沖液和9.0×10-6mol/L魯米諾及8.8×10-7mol/L過氧化氫溶液進(jìn)行清除H2O2試驗(yàn);使用pH值為11.0的緩沖液和5.4×10-5mol/L魯米諾及1.51×10-5mol/L連苯三酚溶液進(jìn)行清除O·-2自由基試驗(yàn)。

3.2 在線檢測消癌平注射液清除H2O2及O·-2 自由基活性

樣品中成分經(jīng)色譜柱分離后，DAD檢測器和CL檢測器同步記錄色譜信號和清除自由基信號。因此，通過HPLC-CL可以同時(shí)獲得樣品的HPLC色譜圖和相應(yīng)的活性圖譜。由圖2可見，消癌平注射液HPLC指紋圖譜中1，2，3，4號峰信號較強(qiáng)，其清除H2O2能力也較強(qiáng)。在清除O2·-自由基方面，4號峰顯示較強(qiáng)的活性，1，2，3號峰較弱。清除H2O2的檢測信號強(qiáng)度明顯高于O2·-自由基，這可能是因?yàn)镠2O2和O2·-自由基本身氧化魯米諾的能力不同，而且在這種檢測方法中，H2O2是被直接檢測的，是在檢測過程中由反應(yīng)產(chǎn)生的［4］。

3.3 HPLC-MS 分析

HPLC-MS/MS洗脫系統(tǒng)的確立:基于獲得穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，3.1項(xiàng)中確定了0.1%磷酸和乙腈作為HPLC-CL的洗脫系統(tǒng)，而質(zhì)譜檢測中要求使用揮發(fā)性的酸試劑，因此本文根據(jù)與2.2項(xiàng)條件相同的洗脫梯度，通過改變0.1%磷酸為0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.1% 醋酸、0.2% 醋酸，分別考察 HPLC色譜圖的變化，結(jié)果顯示使用0.2%甲酸，相應(yīng)色譜圖出峰數(shù)目和出峰順序均未改變，對色譜圖中活性物質(zhì)的歸屬沒有影響，如圖3所示。最終采用0.2%甲酸-乙腈為HPLC-MS/MS洗脫系統(tǒng)。

圖2 消癌平注射液紫外圖譜(300 nm)及其清除H2O2和O·－自由基化學(xué)發(fā)光圖譜。(A)紫外圖譜、(B)清除2 H2O2圖譜、(C)清除O2· -自由基圖譜Figure 2 Chromatogram with UV at 300 nm detection and CL detection of Xiaoaiping based upon H2O2and O·－elimination.(A)UV detection.(B)CL detec-2 tion of Xiaoaiping based upon H2O2elimination.(C)CL detection of Xiaoaiping based upon O2·-elimination.

圖3 流動相為0.2%甲酸時(shí)消癌平注射液色譜圖Figure 3 Chromatogram of Xiaoaiping with the mobile phase of 0.2%formic acid

3種綠原酸類成分的鑒別:消癌平注射液中主要含酚酸類物質(zhì)，已知的有綠原酸等。分析HPLCMS/MS譜圖，發(fā)現(xiàn)色譜峰 1，2，3的［M-H］-離子m/z均為353。綠原酸有多種同分異構(gòu)體，但具有不同的二級質(zhì)譜特征［15-17］:3-咖啡酰奎尼酸二級質(zhì)譜有m/z 191的基峰，m/z 179峰強(qiáng)度約為基峰強(qiáng)度的50%;5-咖啡酰奎尼酸二級質(zhì)譜有m/z 191的基峰，m/z 179峰強(qiáng)度小于基峰強(qiáng)度的5%，4-咖啡酰奎尼酸二級質(zhì)譜有m/z 173的基峰，同時(shí)有m/z 179、191峰。圖5為3種物質(zhì)的二級質(zhì)譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對照及二級質(zhì)譜特征，推測1號峰為3-咖啡酰奎尼酸，2號峰為5-咖啡酰奎尼酸，3號峰為4-咖啡酰奎尼酸。

圖4 消癌平注射液總離子流圖Figure 4 Total ion chromatogram of Xiaoaiping

圖5 綠原酸同分異構(gòu)體的二級質(zhì)譜圖Figure 5 MS2spectra for isomeric caffeoylquinic acids

其他物質(zhì)的分析:關(guān)于消癌平注射液中的化學(xué)成分，文獻(xiàn)報(bào)道的僅有綠原酸、咖啡酸［18］。從通關(guān)藤藥材中分離到的酚酸還有香草酸［19-20］。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)，推測4號峰為酚酸類物質(zhì)，但其與咖啡酸、香草酸的質(zhì)譜數(shù)據(jù)不匹配，由于文獻(xiàn)報(bào)道有限，因此關(guān)于其成分的確證有待進(jìn)一步研究。目前，關(guān)于通關(guān)藤抗癌物質(zhì)基礎(chǔ)的研究主要集中于其中的甾體類化合物，本文未檢測到甾體類化合物，原因可能為:含量低于檢測限;本文中HPLC流動相只能洗脫出極性較大的化合物，極性較小的甾體類可能未被洗脫。

4 結(jié)語

腫瘤發(fā)生與自由基密切相關(guān)，消癌平注射液中酚酸類物質(zhì)清除自由基能力較強(qiáng)，提示清除自由基可能是消癌平注射液發(fā)揮抗腫瘤作用的一種途徑。

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