當(dāng)歸補血總苷HPLC指紋圖譜研究

黃趙剛， 高 建，2，3*， 李 萍， 高 雷， 朱冬春， 夏 泉， 許杜娟，3

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，國家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級實驗室，安徽 合肥230022;2.中國藥科大學(xué)“現(xiàn)代中藥”教育部重點實驗室，江蘇南京210009;3.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，抗炎免疫藥理學(xué)安徽省重點實驗室，安徽合肥230032)

當(dāng)歸補血湯系中醫(yī)經(jīng)典名方，始載于李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，按黃芪-當(dāng)歸為5∶1組成，具補氣生血、扶正固本等功效，臨床上用于多種疾病的治療。現(xiàn)代藥理研究表明［1-4］:當(dāng)歸補血湯具有促進造血、調(diào)節(jié)免疫功能、保護心腦血管、抗纖維化、對化療藥具增效減毒等作用。當(dāng)歸補血總苷是當(dāng)歸補血湯皂苷類總成分，為其主要活性部位之一，本文建立了當(dāng)歸補血總苷的HPLC指紋圖譜，意在加強其質(zhì)量控制。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 A gilent 1100高效液相色譜儀(ALS自動進樣器，四元泵)，DAD檢測器，分析天平(Mettler Toledo AG285)。

1.2 試藥 乙 腈(HPLC級，CALEDON公司)，水為純化水。黃芪、當(dāng)歸藥材均由本院中藥庫提供，購自南京醫(yī)藥合肥天星有限公司，經(jīng)鑒定黃芪為膜莢黃芪Astragalus membraceus(Fisch)Bge.，當(dāng)歸為 A ngelica sinesia(Oliv.)Diels 。

2 方法結(jié)果

2.1 色譜條件 色 譜柱:Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水梯度洗脫，梯度程序(乙腈):0 ～7 min 8%，15 min 20%，30 min 30%，45 min 60%，50～55 min 100%;流速:1.0 mL/min;檢測波長:203 nm;柱溫:30℃ 。

2.2 供試品溶液的制備 取 黃芪、當(dāng)歸藥材粗粉，稱取黃芪、當(dāng)歸12.0 g(5∶1)，加10倍75%乙醇回流提取2次，合并醇提液趁熱過濾，減壓濃縮回收乙醇;濃縮物加適量蒸餾水溶解，水飽和正丁醇(1∶1)萃取3次，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇后得粗總苷;粗總苷用大孔吸附樹脂吸附，分別以蒸餾水，40%乙醇和70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干，加流動相(乙腈-水=50∶50)溶解并定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾即得。

2.3 對照溶液的制備 分 別取黃芪藥材粗粉10.0 g、當(dāng)歸藥材粗粉2.0 g，按2.2項下操作，得黃芪、當(dāng)歸單味藥材對照液。

2.4 精密度試驗 取 同一份供試品溶液，進樣10 μL，連續(xù)進樣5次，按2.1項條件分析，結(jié)果各峰保留時間的RSD小于1%，峰面積的RSD小于3%，說明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取 同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進樣10 μL，按2.1項條件分析，結(jié)果各峰保留時間的RSD小于2%，峰面積的RSD小于3%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗 取 同一批次黃芪、當(dāng)歸按2.2項下操作，一式5份，按2.1項條件進樣10 μL，HPLC 分析，結(jié)果各峰保留時間RSD的小于2%，相對峰面積的RSD小于3%，以第1份為參比，其余各份的相似度大于0.971。說明重復(fù)性較好。

2.7 樣品分析 分 別取不同批次供試品溶液、不同批次對照溶液，按2.1項條件進行分析，結(jié)果見圖1，表1，表2。

圖1 當(dāng)歸補血總苷、當(dāng)歸提取物和黃芪提取物HPLC圖譜

表1 10批次當(dāng)歸補血總苷相對保留時間

表2 10批次當(dāng)歸補血總苷相對峰面積

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過對10個不同批次當(dāng)歸補血總苷的HPLC分析，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件進行指紋峰的分析，多點校正后進行自動匹配，確定了13個共有峰。10批樣品共有峰面積占總峰面積百分比分別為:90.7、92.4、94.5、94.2、95.2、95.4、92.9、90.9、92.2、93.8;主要共有峰面積百分比見表3。經(jīng)與單味藥材HPLC圖譜比較，其中1、3、5號峰為當(dāng)歸和黃芪單味藥材提取物共有，13號峰歸屬當(dāng)歸，其余號峰歸屬黃芪。分析結(jié)果顯示:13個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的重現(xiàn)性較好，RSD分別為0.2% ～1.0%1.6% ～4.6%，表明本法重現(xiàn)性較好，10 個批次當(dāng)歸補血總苷的質(zhì)量基本一致。

表3 主要共有峰面積占總峰面積百分比/%

將10批樣品供試品溶液色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，自動匹配后生成對照圖譜，以此作為當(dāng)歸補血總苷的對照指紋圖譜，進行相似性評價。結(jié)果10 批樣品的相似度分別為:0.921、0.937、0.955、0.948、0.959、0.967、0.938、0.932、0.934、0.942;10 批樣品的相似度均大于0.9，說明以上述當(dāng)歸補血總苷制備工藝制備的樣品一致性較好。

3.2 討論

在HPLC指紋圖譜流動相系統(tǒng)的選擇中，分別對乙腈-水系統(tǒng)［5］、甲醇-水系統(tǒng)［6］進行考察，結(jié)果表明，乙腈-水系統(tǒng)分離效果較好，各峰的分離度良好，基線穩(wěn)定，有利于指紋圖譜的分析，因此采用乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)。由于當(dāng)歸補血總苷無明顯特征紫外吸收，故選擇檢測波長為203 nm(末端吸收)。7號色譜峰相對分離較好，附近無其他峰干擾，峰面積適中，因此選擇7號峰作為參比峰。

中藥指紋圖譜能夠基本反映中藥的整體宏觀特征，可以從整體上準確、量化地對中藥進行真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價。計算并評定各個批次中藥材產(chǎn)品的指紋圖譜間的整體相似程度，根據(jù)整體相似程度來估算它們各自化學(xué)組成的整體波動程度，可以為有效控制中藥材產(chǎn)品的質(zhì)量提供科學(xué)可靠的依據(jù)。本實驗研究不同批次制備的當(dāng)歸補血總苷樣品的指紋圖譜，實驗的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好，指紋圖譜的穩(wěn)定性較好，能有效體現(xiàn)出對當(dāng)歸補血總苷鑒別的特征性和專屬性，符合指紋圖譜的要求，可用于當(dāng)歸補血總苷的質(zhì)量控制。

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