骨髓間充質干細胞治療視網膜疾病的實驗進展

王珊珊 徐國興

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骨髓間充質干細胞治療視網膜疾病的實驗進展

王珊珊1.2徐國興1

1.福建醫科大學第一臨床醫學院 2.福建衛生職業技術學院

各種視網膜疾病，如視網膜色素變性(RP)、年齡相關性黃斑病變(AMD)等，視網膜光感受器的損傷可導致不可逆的視力喪失。對于此類疾病，人們嘗試了很多方法來修復視網膜細胞變性，阻止視網膜光感受器的喪失，其中包括營養支持治療、基因治療、神經生長因子、以及人工眼等。然而，這些方法都未能取得確切的臨床療效，因此人們開始轉向尋找合適的細胞源作為移植物，通過視網膜的細胞移植來代替丟失的細胞或者起到支持細胞的作用，以阻止更進一步的細胞丟失。

隨著干細胞應用技術不斷突破，為我們最終有效的治療這些眼病，恢復患者的視功能提供了一個良好的契機。再加上眼睛的解剖結構明確，并具有透明的屈光介質、便于操作定位及觀察的特點，使得與其他神經系統疾病相比，視網膜疾病在細胞移植方面發展得更為迅速。

1 間充質干細胞具有優勢

干細胞是生物個體生長發育中具有自我更新、增殖和多向分化潛能的細胞群體，分為胚胎干細胞和成體干細胞。目前研究較多用于視網膜移植的干細胞包括胚胎干細胞(ESC)和成體干細胞中的間充質干細胞(mesenchymal stemcells，MSCs)、神經干細胞(NSC)和視網膜干細胞/祖細胞(RPC)等。但由于MSCs易于獲得，且無胚胎干細胞或神經干細胞的倫理障礙，同時也避免了異體移植的免疫排斥反應，在目前臨床前試驗和臨床應用中尚未見致畸作用的發生。因此，MSCs在干細胞移植方面具有優勢，也是目前研究相對深入的一群具有多向分化潛能的成體干細胞。

然而，要想實現MSCs的臨床應用，就必須克服MSCs的選擇、培養擴增、體外標記、植入體內及植入后的融合等一系列技術難題。目前，MSCs移植主要以大鼠骨髓間充質干細胞實驗對象，已進入動物實驗的階段，雖取得了一些突破，但同時也存在不少難題。現從大鼠骨髓間充質干細胞分離培養研究近況和大鼠骨髓間充質干細胞誘導分化視網膜神經樣細胞的研究近況二方面進行綜述。

2 大鼠骨髓間充質干細胞分離培養研究近況

間充質干細胞廣泛分布于人體各種器官和組織，但最易得到、最富集和研究最多的是來源于骨髓。骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種具有多向分化潛能的成體干細胞。在20世紀80年代初人們通過骨髓培養發現，它是中胚層發育的早期細胞，可以分化為神經細胞、成骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、肝細胞等。由于其多分化潛能和強大的自我更新能力，使BMSC可以作為種子細胞用于組織工程和基因治療的研究。

3 獲取含BMSCs的骨髓

據研究，BMSCs在骨髓中的濃度不高，約占有核細胞的0.001%～0.01%，要想成功獲取高質量的BMSC需要在選擇大鼠并用適當的方式去獲取BMSCs的骨髓液。

3.1 不同周齡大鼠骨髓MSCs的分離效果不同

大部分文獻報道是以周齡作為選擇大鼠的指標。Zhang等認為骨髓MSCs的增殖能力與動物年齡有關，隨著年齡增加，成纖維細胞集落形成單位(CFU-F )測定顯示骨髓克隆形成細胞的數量逐漸遞減。謝茂松等研究發現，在相同接種密度條件下，觀察到1 mo齡鼠的增殖能力較2mo和4 mo齡鼠強，2mo齡鼠的增殖能力較4mo齡鼠強。晏丹等對1mo到2mo齡鼠作了進一步的分析，結果發現：4周齡大鼠下肢骨分離所得的細胞數較少，原代培養長出的細胞克隆少，很難匯合成片；8周齡大鼠骨髓中含有較多的脂肪細胞，密度梯度離心后，在白膜層形成顆粒狀聚集物，影響后續的分離與培養效果；6周齡的大鼠在細胞分離的質和量上達最佳效果。故晏丹等主張選擇6周齡的大鼠作為實驗動物。

3.2 不同體重大鼠骨髓MSCs的分離效果不同

也有文獻報道是以體重作為選擇大鼠的指標。Zhang等[1]認為動物體重對骨髓MSCs的分離有影響：體重≥250g的大鼠骨髓中含有較多的脂肪細胞，密度梯度離心后，在白膜層形成顆粒狀聚集物，影響分離效果；體重<150g的大鼠骨骼細小，分離所得的細胞數少。Zhang等認為，150~250g左右的大鼠在骨髓MSCs分離的質和量上可達到較佳效果。

3.3 獲得含BMSC骨髓液的方法

3.3.1沖洗法

骨髓沖洗法的剪斷股骨、脛骨的方法有二種，即干骺端和骨干中間剪斷法二種。謝茂松等[2]研究發現，剪去干骺端法和骨干間剪斷法在細胞純度差異無統計學意義，但獲取的MMSC細胞上，剪去干骺端法比骨干間剪斷法數量少，這可能與BMSCs主要在干骺端有關。

3.3.2夾碎震蕩法

余勁明等用將大鼠的股骨、脛骨完全剝離，清除肌肉組織后，直接用止血鉗將骨完全夾碎，尤其是干骺端，后充分暴露骨髓腔，通過震蕩盡可能使造血干細胞置于緩沖液中。再用篩網過濾去除碎骨，離心后獲取細胞。改良操作后，與傳統的沖洗法相比，操作時間縮短，獲取的P0細胞活性沖洗好，更有利于細胞的擴增和純化。余勁明等[3]認為原因是由于實驗動物的骨頭較細，傳統的沖洗法使用注射器沖出骨髓細胞的操作時間長，使獲得的BMSCs細胞活性下降。

4 分離純化BMSCs

4.1 分離法的種類

BMSCs最初的分離培養方法由Friedenstein于1976年建立，主要通過貼壁培養進行細胞分離。近年來國內外實驗中對MSCs的提取和擴增方法有如下幾種：單純貼壁篩選法、免疫磁珠分離法、流式細胞儀分離法及密度梯度離心法。

4.1.1流式細胞儀分離法。流式細胞儀分離法是根據不同細胞具有不同的表面標志，以熒光抗體與細胞表面標志結合，然后用流式細胞儀進行分選，該方法的優點是分離迅速、純度高，但儀器昂貴，費用較高，對含量太低的細胞難以分離，而且不能處理大量的樣品。

4.1.2免疫磁珠分選法。免疫磁珠分選法是根據磁珠具有既能結合蛋白質又可被磁鐵所吸附的特性進行分選的。經過一定處理將抗體或抗原結合在磁珠上，使之成為抗體或抗原的載體，磁珠上抗體或抗原與特異性抗原或抗體結合后，形成抗原抗體磁珠免疫復合物，這種復合物在磁力作用下，發生力學移動，使復合物與其他物質分離，從而達到分離特異性抗原或抗體的目的。該方法的優點是避免了免疫毒素和補體裂解帶來的非特異性殺傷作用，且可以處理大量的細胞樣品，因此在臨床和基礎研究中具有很誘人的應用前景，但價格昂貴、操作復雜。

4.1.3單純貼壁篩選法。貼壁篩選法是利用細胞貼壁時間及貼壁牢固性的不同，逐步將非貼壁細胞和其它雜質細胞去除的一種簡單易行的方法，實驗表明貼壁法分離大鼠BMSCs傳10多代仍能保持旺盛的生長和增殖能力。

4.1.4密度梯度離心法。密度梯度離心法是利用MSCs與其他細胞密度的不同，用特定密度的淋巴細胞分離液將MSCs分離出來。常用分離液有密度可調的Percoll分離液和密度固定的聚蔗糖-泛影葡胺分層液Ficoll-Hypaque (商品名Fi-coll )分離液二種。有研究表明，在MSCs的分離中，Percoll較Fi-coll能得到更純的細胞群體，并認為Percol與Fi-coll相比，Percoll具有無毒、無刺激性，能較好地保持細胞活性，并且可用于分離不同密度的細胞或顆粒等優點。余勁明等[3]認為不同密度Percoll的分離效果不同，他們采用70%的Percoll液(密度1.087g/mL，大鼠單個核細胞密度m)和57%的Percoll液(密度為1.073g/mL)進行密度梯度離心，結果顯示，70%Percoll分離效果欠佳，紅細胞沉降不良；而57%Percoll分離效果較好，白膜層未見紅細胞摻雜。

4.2 各種分離法的比較

因為骨髓間充質干細胞目前還沒有公認的獨特抗原表型，再加上免疫磁珠分離法和流式細胞儀分離法分離出的細胞數量少，活性低，加之技術難、成本高，所以較少采用。目前大部分實驗室分離使用的仍是單純貼壁篩選法或密度梯度離心法，免疫磁珠分離法和流式細胞儀分離法則用在鑒定上。

密度梯度離心法和單純貼壁篩選法兩種方法均可分離培養出較純化的BMSCs。楊麗等[4]研究發現：與密度梯度離心法相比，全骨髓貼壁法操作步驟簡單，既降低了離心對細胞的損害，又減少了污染機會，節省經費，且分離的骨髓間充質干細胞貼壁時間短，增殖快，細胞數量多，經傳代后能夠純化，這與以往的文獻報道一致。李爽等則認為：密度梯度離心、貼壁培養和消化控制相結合，是一種比較理想的分離純化方法。趙瑛等[5]采用Percoll(1. 073 g/mL)密度梯度分離和貼壁培養法相結合的方法能夠成功分離純化。

4.3 分離法的改良

由于單純貼壁篩選法的純度不如密度梯度離心法，有學者對分離方法進行改良。

劉東寧等采用0.85% NH4Cl溶液分離培養Long-Evans大鼠股的BMSCs，其原理為0.85% NH4Cl溶液可降低環境滲透壓，選擇性快速裂解紅細胞，所余細胞成分即主要為白細胞和有核骨髓細胞，通過定期更換培養液，剔除不貼壁生長的白細胞和造血干細胞，所余貼壁生長細胞即主要為BMSCs。細胞傳P3代后純度高達94%以上，與密度梯度離心法相近。

謝茂松等[2]在換液時運用化學螯合劑EDTA吸收Ca2+、Mg2+，使未貼壁能力弱或粘附而未貼壁的造血系細胞等細胞分離，而對于貼壁能力較強的BMSCs細胞影響極少，從而提高MMSC細胞的純度，使提純的純度與密度梯度離心法比較無顯著差異。

5 鑒定BMSCs

骨髓間充質干細胞目前還沒有公認的獨特抗原表型。所以大多數的實驗室都采取從細胞形態、細胞周期以及表面標志物表達三方面來鑒定BMSCs。

5.1 細胞形態：細胞形態用的標準一致，都為長梭形細胞。

5.2細胞周期測定：都是以BMSCs絕大多數處于靜止期，只有極少量細胞處于增殖期為測定標準。

5.3表面標志物：由于骨髓間充質干細胞的表面抗原不是獨特的，所以目前鑒定培養細胞的方法只能用說明培養細胞既非造血干細胞，也非成纖維細胞，以推測分離培養最大可能是間充質干細胞。國際細胞治療學會間充質及組織干細胞委員會提出了鑒定人來源MSC的3條最低標準：①在標準培養條件下，MSC必須具備對塑料底物的貼附性；②通過FCM檢測，MSC群體表達CD105、CD73及CD 90陽性率≥95%，CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19，HLA-DR陽性率≤2%；③經體外誘導，MSC必須能向少成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞等分化。該標準特別指出，對于動物來源的MSC，除第2條標準不具有普遍意義的適用性外，第1條、第3條描述的生物學特征同樣適用于動物來源的MSC。

大部分的實驗室用骨髓間充質干細胞表達陽性的指標CD29、 CD44以及表達陰性的指標CD34作為鑒定參考指標。也有實驗室用CD14、CD44表達陰性，CD90、CD45表達陽性，來說明已形成了純化的BMSCs細胞群。李爽等選取CD29，CD45，CD105和CD166作為其鑒定標記。

6 體外擴增

6.1 培養基選擇

P0MSCs生長狀況與使用不同血清濃度密切相關，10%血清足夠細胞的生長需要，血清濃度過高則會加速細胞的分化及衰老。研究發現，對于P0細胞而言，含15%FBS培養基中細胞生長明顯快于5%、10%和20%FBS培養基，而無血清培養基中細胞無法生長。而在P3以后的細胞，含5%FBS培養基中細胞生長好，細胞形態大部分為長梭形，15%、20%FBS培養基中細胞生長良好，但出現細胞分化現象，形態改變。因此，建議在原代培養中使用15%FBS，而在BMSCs純化階段，使用5%FBS有利于獲取大量高純度的細胞。

6.2 接種密度

傳統的接種密度為8×103/cm2。但晏丹等[6]通過比較BMSCs傳代時的不同接種密度，認為5×103/cm2接種密度最佳，5×103/cm2接種密度有利于維持BMSCs的多向分化潛能。

6.3 選擇代次

選擇生長狀況良好，增殖能力活躍，形態均一，純度高，尚未出現退化現象，具有良好生物學特性的一代。研究發現，P0細胞增殖較慢，但是在傳代純化細胞后，由于BMSCs所占的比例增加，細胞增殖逐漸加快，P3~P9細胞按1∶3傳代后，均可在一周內再次傳代。P10大鼠BMSCs出現細胞生長變慢，老化現象。李爽等[7]研究發現，P1-P5代最快，以后生長速度減慢。這與以往的有些文獻報道不同。楊晉等研究結果表明，培養的骨髓間充質干細胞從第2代開始到第5代細胞生長周期穩定，從第5代以后，細胞生長逐漸減慢，傳代周期延長，約需要10d左右。目前國內外大部分實驗中使用的均為P3~P10。

穩定、有效的MSCs分離、體外培養與擴增的方法為今后骨髓BMSCs的較為深入的研究奠定了基礎。

7 MSC在眼科的應用挑戰

MSC作為一種成體干細胞，除具有干細胞的共性外，還具有如下優勢：取材方便且對機體無害；由間充質干細胞誘導來的組織在進行移植時不存在組織配型及免疫排斥問題；間充質干細胞在理論上可以向任何組織分化。盡管近年來對MSC的研究取得了很大進展，但仍然存在以下問題尚待解決：(1)成體干細胞含量極微，每10萬個骨髓有核細胞中約含有1個MSC，并且隨著年齡的增加或體質的衰弱，細胞的數量逐漸減少；(2)目前尚未能建立鑒定MSC的統一標準，至今還未能篩選到MSC特異性的標記分子；(3)MSC具有多系分化潛能，但向多系分化的效率尚不太理想，尤其是在體外的分化是否會引起MSC遺傳特性的改變還有待進一步證實；(4)是何種信號誘導了骨髓MSC向多系分化，其誘導分化的分子機制尚不明了。綜上所述，雖然理論上干細胞研究為眼科學者展示了美好的前景。然而，只有在具有巨大挑戰性的屏障問題獲得解決，人類疾病的治療才能邁入“干細胞”時代。

[1] Zhang H, Fazel S, Tian H, et al. Increasing donor age adversely impacts eneficial effects of bone marrow but not smooth muscle myocordial cell therapy [J]. Am 1 Physiol Heart Circ Physiol, 2005,289: 2089-2096.

[2] 謝茂松,徐國興,李瓊,等.大鼠骨髓間充質干細胞分離培養方法的比較[J].國際眼科雜志,2007,7(5) : 1285-1287.

[3] 余勁明,蔡德鴻,張樺,等.改良法分離培養大鼠骨髓間充質干細胞的實驗研究[J].西醫科大學學報,2008 ,25 (6):825.

[4] 楊麗，張榮華，謝厚杰,等.建立大鼠骨髓間充質干細胞穩定分離培養體系與鑒定[J].中國組織工程研究與臨床康復, 2009,13(5):6.

[5] 趙瑛. SD大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養和鑒定[J].重慶師范大學學報(自然科學版), 2008,25(1):75-77.

[6] 晏丹，舒賽.大鼠骨髓間充質干細胞分離與培養條件的優化研究[J].現代生物醫學進展, 2008, 8(1):37.

[7] 李爽,朱家源,朱斌,等.大鼠骨髓間充質干細胞的體外分離培養及其生長特性和表型[J].中華實驗外科雜志,2007 , 24(12):1601-1602.

福建省重點科研課題（基金編號：2008Y0040）。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。