線形程序性壞死在不同腫瘤局部微環境中分布的初步觀察*

劉艷榮 古 強 張丹芳 孫 濤 張詩武 趙秀蘭 韓春榮 孫保存

經典理論認為，細胞凋亡是程序化的主動死亡過程[1]，而細胞壞死則是突發性的、被動的死亡形式[2]。目前研究表明,在某些情況下壞死也可能是群體細胞在基因調控下發生的主動性死亡過程[3]。在小鼠黑色素移植瘤HE染色切片中可觀察到腫瘤組織內出現線形分布或網狀分布的一群胞核深染、胞漿濃縮且細胞間彼此分離的瘤細胞，這些條帶結構按一定的空間距離分布且彼此連接，免疫組化和電鏡觀察結果提示這些瘤細胞可能為腫瘤細胞的一種特殊的程序性死亡形式，筆者將其命名為“線形程序性壞死”（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN）[4]。本研究通過建立荷瘤小鼠缺血模型和生物力學模型，初步探討腫瘤局部微環境對腫瘤細胞發生LPPCN的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞系 實驗動物采用6~8周齡，20~22 g，C57BL小鼠，雄性，SPF級，購自中國醫學科學院實驗動物研究所；鼠源性黑色素瘤細胞B16（C57BL/6小鼠來源黑色素瘤）單細胞懸液由天津醫科大學病理教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 制作小鼠缺血后肢移植瘤模型 腹腔注射氯氨酮40 μL麻醉小鼠。乙醇消毒小鼠局部皮膚,在其左側鼠蹊部橫行切開小鼠皮膚分離肌肉,見股動脈及其分支。游離左側股動脈主干,6.0號絲線分別結扎股動脈遠端和近端,從中間剪斷股動脈,4.0號絲線毯邊縫合傷口,碘伏清潔傷口。股動脈結扎術后5 h,取凍存B16單細胞懸液,復蘇后將0.2 mL瘤細胞懸液(注射細胞數為0.2×107)接種至小鼠左右后肢。接種時由小鼠大腿向腳踝方向進針,以防瘤細胞接種至鼠蹊部。分組：C57BL小鼠9只，左后肢移植瘤為缺血組，右后肢移植瘤為對照組，每天觀察小鼠雙后肢皮膚顏色、溫度、活動度和手術傷口,每天測量腫瘤長徑和短徑。接種移植瘤后15 d處死小鼠，觀察腫瘤組織局部侵襲情況和生長方式，取瘤組織及近鼠蹊部側骨骼肌組織常規石蠟包埋并制作4 μm組織切片[5]。

1.2.2 制作小鼠生物力學模型 擴增并傳代B16細胞，胰酶消化，0.9%NaCl重懸，調整細胞濃度至1×107個/mL。75%乙醇消毒并提起小鼠腹部皮膚，注射器吸取細胞懸液0.2 mL進行接種，保證瘤細胞進入腹腔。腹腔接種完成后75%乙醇消毒小鼠左后肢皮膚，將0.2 mL瘤細胞懸液接種于小鼠左后肢肌肉，注意由小鼠大腿向腳踝方向進針，防止瘤細胞懸液回流至鼠蹊部。分組：C57BL小鼠10只，腹腔組即腹腔移植瘤，后肢組即左后肢移植瘤。接種移植瘤后9 d處死小鼠,觀察腫瘤組織局部侵襲情況和生長方式,取瘤組織常規石蠟包埋并制作4 μm組織切片。

1.2.3 HE染色和免疫組織化學染色 HE染色按常規步驟進行。用于免疫組化的基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9兔抗小鼠多克隆抗體購自labvision公司。免疫組化實驗步驟：4 μm連續切片常規脫蠟水化；3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6．0）微波熱修復15 min；室溫下滴加正常血清封閉20 min，滴加一抗4℃過夜；次日晨恢復至室溫，PBS沖洗，滴加PV6001（兔即用型非生物素兩步法檢測試劑盒，北京中杉金橋生物有限公司）；DAB顯色，蘇木素淺染細胞核；脫水透明，中性樹膠封片。采用已知陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 計數方法 （1）LPPCN細胞百分率：先用100倍光鏡進行觀察，尋找LPPCN最多的區域，然后在400倍光鏡下隨機抽取HE切片的5個LPPCN視野，每個視野之間至少間隔1個視野大小的距離，然后計數每個高倍視野下每100個腫瘤細胞中的LPPCN細胞數目，取其均值計算LPPCN細胞百分率。（2）免疫組化計數方法：400倍光鏡下隨機抽取免疫組化染色切片上的5個視野，每個視野計數100個細胞，計數其中的陽性細胞數，取其均值計算陽性細胞百分率。

2 結果

2.1 腫瘤生長情況 （1）缺血模型。接種B16細胞懸液后第15天處死全部小鼠。缺血組和對照組分別有8只小鼠肉眼可見黑色素移植瘤于肌間生長（缺血組和對照組未成瘤的并非同一只小鼠）。缺血組瘤組織多成條索狀，對照組瘤組織呈球狀。（2）生物力學模型。不同壓力環境中黑色素瘤生長情況：移植瘤接種第9天，處死小鼠剖開腹腔，9只小鼠肉眼可見黑色素瘤在腹腔內彌漫生長，瘤組織呈黑色、質軟，壞死較少。10只小鼠均有移植瘤生長于后肢肌肉間隙，呈球狀或條索狀，黑色，表面見血管匍行，瘤組織與周圍肌肉緊密相連；鏡下可見瘤細胞生長活躍，侵入周圍肌纖維間隙，將肌梭沖斷。缺血組、對照組、后肢組、腹腔組小鼠黑色素移植癌的HE染色切片中均可觀察到呈線形或網狀分布的一群胞核深染、碎裂溶解的腫瘤細胞，這些條帶結構彼此連接且按一定的空間距離分布。

2.2 各組LPPCN細胞百分率比較 缺血組LPPCN細胞百分率高于對照組，差異有統計學意義（t＝3．926，P<0．01）；后肢組 LPPCN 細胞百分率高于腹腔組，差異有統計學意義（t＝4．190，P<0．01），見圖 1。

2.3 腫瘤組織MMP-2、MMP-9免疫組化結果比較 MMPs主要表達于腫瘤細胞和間質細胞的細胞漿內，陽性反應產物呈棕黃色，呈彌漫狀分布。MMP-2、MMP-9在缺血組瘤組織的陽性率分別高于對照組，差異有統計學意義（t分別為8．978、12．830，均 P ＜ 0．01）；MMP－2、MMP－9 在后肢組瘤組織的陽性率高于腹腔組，差異有統計學意義（t分別為8．817、16．970，均 P ＜ 0．01），見圖 1。

3 討論

1999年，Maniotis等[6]在研究高度惡性黑色素瘤時報道了一種不依賴于內皮細胞的全新的腫瘤內血液供應模式：血管生成擬態（VM）。其特點是血管壁的內側全部由腫瘤細胞襯覆，而非內皮細胞。目前國內外對VM的研究尚處于起步階段，其確切的分子機制尚不清楚。但大量研究表明腫瘤基質重塑是VM形成的關鍵，腫瘤細胞表達一些蛋白酶類物質（如MMP-2、MMP-9等），這些蛋白酶類物質可通過降解細胞外基質，參與VM形成過程中的基質重塑[7]。

程序性壞死是近年被提出的一種既不同于凋亡，又有別于壞死的細胞死亡形式[3]。這種死亡細胞在形態學上同樣表現為壞死形態，如細胞核出現固縮、碎裂和溶解，沒有凋亡小體的出現，然而卻受到機體多種信號傳導通路的主動調控[8]。此外，凋亡為單個細胞的死亡，其分布較為分散，壞死為群體細胞的死亡，而程序性壞死的細胞則有其特殊的分布形式。

本研究將黑色素瘤細胞株B16接種到C57BL小鼠體內，在腫瘤直徑達2~3 mm時（15 d），HE染色切片中可觀察到大片實體的腫瘤組織內出現條帶樣（線形分布）的一群胞核深染、胞漿濃縮且細胞間彼此分離的瘤細胞。這些核固縮的細胞從形態、基因調控和超微結構等不同于傳統意義上的凋亡、壞死。免疫組化和電鏡觀察提示這些瘤細胞可能為腫瘤細胞的另一種特殊的程序性死亡形式，筆者稱之為“LPPCN”[4]。隨后這些條帶結構內的腫瘤細胞發生核碎裂、溶解，細胞解體，在腫瘤組織內出現了一些分布呈網絡狀的線形空間結構，并出現與內皮依賴性血管相通的現象，有時在一個內皮依賴性血管的周圍可見數個呈網絡狀分布的線形結構。LPPCN和VM的空間分布呈網絡狀，類似于內皮依賴性血管的空間分布。根據上述現象，筆者推測，在腫瘤快速生長期，由于缺氧和組織壓力不斷升高，腫瘤組織中的部分腫瘤細胞死亡，誘導基因活化，通過一系列信號傳導途徑使部分腫瘤細胞發生LPPCN，這些發生LPPCN的腫瘤細胞死亡后殘留的空間框架可以作為VM形成的空間結構基礎。

本研究利用2個經典的動物移植瘤模型，研究了缺氧、壓力與LPPCN形成之間的關系。結果表明，腫瘤組織局部缺氧以及腫瘤生長過程中體積不斷增大，擠壓腫瘤周圍組織所造成的腫瘤組織內的“高壓力”微環境均可以促進LPPCN的形成。進一步研究表明，MMP-2，MMP-9在缺血組和后肢組明顯高表達，提示LPPCN的形成與細胞侵襲能力的提高有關，而MMP-2，MMP-9又是VM形成過程的重要功能性分子。因此，可以推測LPPCN與VM的形成存在重要的相似性和相關性。

作為一種新的腫瘤細胞死亡模式，目前對LPPCN形成的相關理論僅僅局限在描述性的研究，其分子機制尚不清楚。對LPPCN這種腫瘤細胞的特殊死亡形式的研究有可能解釋在腫瘤組織內的缺氧和高壓環境下如何形成血管所需的空間結構。因此如能通過抑制LPPCN，使快速生長的腫瘤中無法形成VM和內皮依賴性血管生成所需的空間，則有可能找到抗血管治療腫瘤的新途徑和新靶點。

[1] Kerr JFR,Wyllie AH，Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J].Br J Cancer,1972,26(4):239-257.

[2] Wyllie AH,Kerr JFR，Currie AR.Cell death:the significance of apoptosis[J].Int Rev Cytol,1980,68:251-306.

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[4] Zhang S,Li M,Zhang D,et al.Hypoxia influences linearly patterned programmed cell necrosis and tumor blood supply patterns formation in melanoma[J].Lab Invest，2009，89(5):575-586.

[5] Hendrix MJ,Seftor RE,Seftor EA，et al.Transendothelial function of human metastatic melanoma cells:role of the micro-environment in cell-fate determination[J].Cancer Res,2002,62(3):665-668.

[6] Maniotis AJ,Folberg R,Hess A，et al.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro:vasculogenic mimicry[J].Am J Pathol，1999，155(3):739-752.

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[8] Kitanaka C,Kuchino Y.Caspase-independent programmed cell death with necrotic morphology[J].Cell Death Differ,1999,6(6):508-515.