菜籽餅粕多糖對D-半乳糖衰老小鼠的抗氧化及免疫調節(jié)作用

雷 紅，孫漢巨，姜紹通

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

菜籽粕含有蛋白質、多糖、植酸、多酚、膽堿、生物素、煙酸、VB1、VB2和豐富的微量元素如鈣、磷等成分，具有較高的利用價值[1]。本課題組已采用脫脂、脫色、堿溶、脫蛋白等提取和純化方法得到菜籽餅粕多糖(PRM)，并考察了PRM對正常小鼠免疫功能和抗氧化功能的影響，結果表明PRM具有免疫促進和抗氧化作用[2-3]。

D-半乳糖(D-gal)可產(chǎn)生擬衰老反應，對氧自由基代謝的損傷、免疫功能的影響與人體衰老的改變基本一致[4-5]。本實驗采用D-半乳糖亞急性人工衰老模型，以肝腎組織中MDA含量、抗氧化酶SOD活性，以及脾細胞增殖反應、巨噬細胞增殖反應、IL-1、IL-2、一氧化氮(NO)產(chǎn)生為指標，探討PRM對D-gal衰老模型小鼠的作用及其抗氧化和免疫調節(jié)作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆明種小白鼠與C57BL/6J小鼠，♂，體質量(20±2) g；購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：皖醫(yī)實動準第01號。

采用脫脂、脫色、堿溶、脫蛋白等提取和純化方法得到PRM，多糖的純度≥95%[2]，臨用時用質量分數(shù)1% CMC-Na溶液稀釋至所需濃度。將VE用少量無水乙醇溶解后，再用1% CMC-Na溶液制成混懸液，供灌胃給藥(乙醇終體積分數(shù)＜0.2%)。

D-半乳糖(D-gal)、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、四甲基偶氮唑鹽(MTT) Sigma公司；1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP) Fluka公司； SOD、一氧化氮(NO)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；1640干粉 Gibco公司；胎牛血清(FBS) 北京元亨圣馬生物技術研究所；VE Merck公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

BIOROD Model 680 CO2培養(yǎng)箱 美國Precision Scientific公司；XSB-1A倒置顯微鏡 梧州光學儀器廠；YP202N 電子天平 上海精密科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫(yī)療器械廠；CyberScan 510 pH 計 Singapore Eutech 儀器公司；GTL 16A 型離心機上海醫(yī)用分析儀器廠；SW-CJ-IFD 型凈化工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；Multiskan全波長酶標儀 Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 分組與給藥

設正常對照組、D-gal模型組、PRM高、低劑量組(400、200mg/kg bw)、VE(50mg/kg bw)

陽性對照組，每組動物10只。D-gal處理4周后，檢測各種指標。

1.3.2D-gal亞急性衰老小鼠模型的建立[6]

小鼠皮下注射D-gal 100mg/kg bw，每日一次，共4周。每周稱體質量一次，并按此調整D-gal劑量。

1.3.3 組織勻漿的制備

于給藥結束后處死小鼠，取出肝臟、腎臟，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱質量。取組織塊300mg，加入預冷的生理鹽水2.7mL(其總質量是組織塊質量的9倍)，于玻璃勻漿器中盡快研碎組織塊(冰浴中進行)。得肝、腎組積勻漿液用于MDA、SOD測定。

1.3.4 MDA含量的測定

采用硫代巴比妥酸比色法[7]，根據(jù)TEP標準曲線計算MDA含量，結果以nmol/mg pro表示。蛋白質含量測定采用改良Lowry氏法。

1.3.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

按SOD測定試劑盒說明書進行，采用黃嘌呤氧化酶法測SOD活性。其活力單位以U/mg pro表示。

1.3.6 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的計算

胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)以胸腺質量(mg)和脾臟質量(mg)與體質量(g)的比值計，單位以(mg/g bw)表示。

1.3.7 小鼠脾淋巴細胞增殖反應

無菌取脾臟，加完全RPMI 1640營養(yǎng)液5mL，輕研，吸脾細胞懸液，不銹鋼網(wǎng)過濾于離心管中，離心(2000r/min，10min)，Hank's液(含 5%FBS)洗兩次，計數(shù)，以完全RPMI 1640營養(yǎng)液制脾細胞懸液(1×107個/mL)。96孔培養(yǎng)板上，加ConA 100μL (終質量濃度3μg/mL)，再加脾細胞懸液100μL，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。每孔加入5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)6h。叩去營養(yǎng)液，每孔加DMSO 150μL，70r/min振搖10min，用酶標儀于波長570nm處測OD值。

1.3.8 脾細胞產(chǎn)生IL-2的檢測[8]

IL-2的產(chǎn)生：無菌取脾臟，常規(guī)制備脾細胞懸液(1×107個/mL)，方法同上。24孔培養(yǎng)板上加入ConA 500 μL (終質量濃度3μg/mL)，脾細胞懸液500μL，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，4℃離心(5000r/min，10min)，收集上清，即為含IL-2活性的上清液。

IL-2的檢測：制備ConA活化的小鼠脾細胞，用以測定IL-2的活性。以完全RPMI 1640營養(yǎng)液配制脾細胞懸液(2×106個/mL)，加入ConA(終質量濃度3μg/mL)，37℃、5% CO2培養(yǎng)4d。收集脾細胞，以完全RPMI 1640營養(yǎng)液制脾細胞懸液(2×106個/mL)。96孔板上，每孔加入稀釋40倍的IL-2待測上清100μL，再加入100μL活化的小鼠脾細胞懸液(2×106個/mL)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。終止前6h，加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)6h。叩去營養(yǎng)液，每孔加DMSO 150μL，用酶標儀于波長570nm處測OD值。

1.3.9 小鼠腹腔巨噬細胞增殖反應

放血處死小鼠，75%酒精浸泡5min。剪撕開腹部皮膚，75%酒精棉消毒。抽冷D-Hank 's 液(pH7.4)10mL注入腹腔，輕晃，抽腹腔細胞懸液6～8mL，注入離心管中，加3%～5%FBS，離心(1500r/min，10min)，Hank's液(含5%FBS)洗兩次，計數(shù)，以完全RPMI 1640營養(yǎng)液制腹腔細胞懸液(2×106個/mL)，加入24孔板，1mL/(孔/樣)，37℃、5% CO2培養(yǎng)2h。吸管輕吸棄培養(yǎng)液，加0.9mL完全RPMI 1640營養(yǎng)液和0.1mL LPS(終質量濃度6μg/mL)，37℃、5% CO2培養(yǎng)6h。吸管輕吸棄培養(yǎng)液，加1mL完全RPMI 1640營養(yǎng)液，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)42h。吸取上清0.8mL，待測 NO、IL-1。每孔補加0.8mL完全RPMI 1640營養(yǎng)液，加入5mg/mL MTT 100μL，稍搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)6h。叩去營養(yǎng)液，每孔加DMSO 750μL，用酶標儀于波長570nm處測OD值。

1.3.10 巨噬細胞產(chǎn)生白介素1(IL-1)的檢測

C57BL/6J小鼠處死，75%酒精浸泡5min。無菌取胸腺于培養(yǎng)皿中，加RPMI 1640營養(yǎng)液5mL，輕研，吸取胸腺細胞懸液，不銹鋼網(wǎng)過濾于離心管中，離心(2000r/min，10min)，Hank's液(含 5%FBS)洗兩次，計數(shù)，以完全RPMI 1640營養(yǎng)液制C57BL/6J小鼠胸腺細胞懸液(2×107個/mL)。96孔板中，每孔加樣本上清(稀釋度1:30)100μL、50μL胸腺細胞懸液、50μL ConA(終質量濃度3μg/mL)，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)48h。終止前6h，加5mg/mL MTT 20μL。叩去營養(yǎng)液，每孔加DMSO 150μL，用酶標儀于波長570nm處測OD值。

1.3.11 巨噬細胞產(chǎn)生NO的檢測

采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果與分析

2.1 PRM對D-gal衰老小鼠體質量的影響

給D-gal前各組小鼠毛色白，有光澤。小鼠頸背部皮下注射D-gal連續(xù)4周后，小鼠毛色灰暗、失去光澤、形體瘦弱、行動緩慢、精神萎靡不振，呈現(xiàn)明顯衰老體征；說明D-gal衰老模型建立成功。各組小鼠體質量變化如表1，結果表明，與正常組相比，D-gal模型組小鼠體質量增長明顯緩慢；PR M高、低劑量(4 0 0、200mg/kg bw)組和VE(50mg/kg bw)組小鼠體質量增長高于模型組小鼠，其中以PRM高劑量組最為明顯。說明PRM對D-gal所致的小鼠體質量增長緩慢有明顯的改善作用。

2.2 PRM對D-gal衰老小鼠肝腎組織MDA含量和SOD活性的影響

正常機體的自由基氧化作用與抗氧化防御作用處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當自由基產(chǎn)生過多，和/或清除自由基的酶系統(tǒng)的防御功能減退時，這種動態(tài)平衡失調，導致生物體老化[9]。脂質過氧化(LPO)產(chǎn)物MDA的水平可反映活性氧損傷效應；SOD活性是反映機體抗氧化能力的重要指標。

表1 PRM對D-gal衰老小鼠體質量的影響(n=10)Table1 Effect of PRM on body weight of D-galactose-induced aged mice (n=10)

表2 PRM對D-gal衰老小鼠肝腎組織中SOD活性的影響(n=10)Table2 Effect of PRM on SOD activity in liver and kidney of D-galactose-induced aged mice (n=10)

表3 PRM對D-gal衰老小鼠肝腎組織中MDA含量的影響(n=10)Table3 Effect of PRM on MDA content in liver and kidney of D-galactose-induced aged mice (n=10)

表2、3表明，與正常對照組相比，D-gal模型組衰老小鼠肝、腎組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高；PRM高、低劑量(400、200mg/kg bw)和VE(50mg/kg bw)均可使MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高。說明PRM可使D-gal衰老小鼠肝腎組織中的脂質過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯降低，同時上調D-gal衰老小鼠的SOD活性，增強其抗氧化能力。

2.3 PRM對D-gal衰老小鼠免疫器官質量、脾細胞ConA増殖反應與IL-2產(chǎn)生的影響

胸腺和脾臟是體內重要的免疫器官。IL-2位居免疫調節(jié)的中心地位，脾淋巴細胞的ConA增殖反應和ConA誘導脾細胞產(chǎn)生IL-2活性是評價機體免疫功能的重要指標[10]。

D-gal衰老小鼠的胸腺指數(shù)明顯低于同齡正常對照鼠，而脾指數(shù)無明顯差異；PR M高、低劑量(4 00、200mg/kg bw)可明顯恢復D-gal衰老小鼠的胸腺指數(shù)(表4)。D-gal衰老小鼠脾細胞Con A増殖反應與IL-2產(chǎn)生均明顯低于同齡正常對照鼠(P＜0.01)；PRM高、低劑量(400、200mg/kg bw)可明顯恢復D-gal衰老小鼠的ConA増殖反應與IL-2產(chǎn)生(P＜0.05或P＜0.01)(表5)。說明PRM具有提高機體保護性免疫反應的作用。

表4 PRM對D-gal衰老小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響(n=10)Table4 Effect of PRM on thymus and spleen indexes of D-galactoseinduced aged mice (n=10)

表5 PRM對D-gal衰老小鼠脾淋巴細胞增殖反應和IL-2產(chǎn)生的影響(n=10)Table5 Effect of PRM on proliferation response of spleen lymphocytes and IL-2 production in D-galactose-induced aged mice (n=10)

2.4 PRM對D-gal衰老小鼠巨噬細胞增殖反應以及IL-1和NO產(chǎn)生的影響

巨噬細胞和淋巴細胞是導致細胞損傷的主要效應細胞，IL-1是淋巴細胞活化因子，為導致細胞調亡的主要因子， NO也參與了凋亡的發(fā)生[11]。

表6 PRM對小鼠巨噬細胞增殖反應和IL-1、NO產(chǎn)生的影響(n=10)Table6 Effect of PRM on proliferation response of macrophages and generation of IL-1 and NO in D-galactose-induced aged mice (n=10)

表6結果表明，D-gal衰老小鼠巨噬細胞增殖反應、IL-1和NO產(chǎn)生均明顯高于同齡正常對照鼠(P＜0.01)；PRM高、低劑量(400、200mg/kg bw)可明顯降低D-gal衰老小鼠的巨噬細胞增殖反應、IL-1和NO產(chǎn)生(P＜0.05)，說明菜籽多糖具有抑制機體破壞性免疫反應的作用。

3 結 論

3.1 PRM(400、200mg/kg bw)對D-gal所致的小鼠體質量增長緩慢有明顯的改善作用。

3.2 PRM(400、200mg/kg bw)可使D-gal衰老小鼠肝腎組織中的脂質過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯降低，同時上調抗氧化酶SOD活性。說明PRM可降低衰老前期小鼠體內活性氧的損傷效應和改善其體內抗氧化能力。

3.3 PRM (400、200mg/kg bw)可明顯提高D-gal衰老小鼠的胸腺指數(shù)，并可明顯恢復D-gal衰老小鼠低下的脾細胞ConA増殖反應與IL-2產(chǎn)生；說明PRM具有提高機體保護性免疫反應的作用。

3.4 PRM(400、200mg/kg bw)可明顯降低D-gal衰老小鼠升高的巨噬細胞增殖反應、IL-1和NO產(chǎn)生。說明PRM具有抑制機體破壞性免疫反應的作用。

[1] 嚴奉偉, 鄧明, 朱建飛.菜籽粕綜合利用[J].糧食與油脂, 2005(9): 6-8.

[2] 孫漢巨, 姜邵通, 趙榮敏.菜籽餅粕多糖對小鼠免疫功能的影響[J].食品科學, 2008, 29(11): 567-571.

[4] LEI Hong, WANG Bin, LI Weiping, et al.Anti-aging effect of astragalosides and its mechanism of action[J].Acta Pharmacol Sin,2003, 24(3): 230-234.

[5] 張石寧, 陳明, 肖紅, 等.D-半乳糖致衰老模型的研究[J].臨床精神醫(yī)學雜志, 1998, 8(6): 327-328.

[6] 初曉, 姚如泳, 韓志武.茶多酚對D-半乳糖致衰老小鼠免疫功能的調節(jié)作用[J].中國醫(yī)院藥學雜志, 2006, 26(5): 637-638.

[7] 鐘福孫, 胡文藝, 馮弛.硫代巴比妥酸比色法測定血清過氧化脂質[J].臨床檢驗學雜志, 1986(4): 129-130.

[8] 丁桂鳳, 席宏麗, 鄧玉蘭.用活化小鼠脾細胞測定IL-2[J].上海免疫學雜志, 1988, 8(1): 64-66.

[9] NOHL H.Involvement of free fadicals in ageing:a consequence or cause of senescerce[J].British Medical Bulletin, 1993, 49(3): 653-658.

[10] 黃鳳杰, 吳梧桐.鯊肝活性肽S-8300免疫調節(jié)作用的研究[J].中國天然藥物, 2005, 3(2): 121-123.

[11] MALEK M A, MOHAMMAD A.Nitric oxide involvement in pancreaticβcell apoptosis by glibenclamide[J].Nitric Oxide, 2006, 14(1):39-44.