雙孢菇培養(yǎng)基堆制產(chǎn)熱過程中微生物變化對其理化性質(zhì)的影響

劉 燦，生吉萍，鄒積華，王鴻磊，丁 強，申 琳,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，山東 煙臺 264067)

雙孢蘑菇[Agaricus bisporus(Large) Sing]是目前世界上人工栽培最廣泛、產(chǎn)量最高、消費量最大的食用菌[1]。雙孢菇培養(yǎng)料發(fā)酵分為一次發(fā)酵和二次發(fā)酵，目前國內(nèi)外都以二次發(fā)酵為主，二次發(fā)酵的主流是采用發(fā)酵倉系統(tǒng)模式進行的[2]。機械化生產(chǎn)雙孢菇時，培養(yǎng)基發(fā)酵主要采用現(xiàn)在室外簡易棚中進行前發(fā)酵，然后在隧道中進行后發(fā)酵，后發(fā)酵的隧道采用電腦自動控制生產(chǎn)，控溫、控濕、控氣[3]。通過二次發(fā)酵，培養(yǎng)料中存在著復(fù)雜的生物降解作用，不同種類的微生物群落交替作用，結(jié)合各種化學(xué)反應(yīng)，使得培養(yǎng)料成為有利于蘑菇菌絲生長的選擇性基質(zhì)[4]。

目前，對于培養(yǎng)料二次發(fā)酵過程是一個非人工加熱而自產(chǎn)熱過程，其中微生物交替及代謝起到非常重要的作用。前發(fā)酵過程中，一些中溫微生物首先利用原料中簡單的有機質(zhì)，產(chǎn)生有機酸、CO2和熱量，使料溫上升，嗜熱微生物開始代替中溫微生物，成為優(yōu)勢群落。在堆制前期料溫升至60℃以上時，細菌能大量繁殖，培養(yǎng)料中易揮發(fā)固體和大量簡單的易被降解的糖由細菌分解掉[5]，這時很少分離到真菌[6]。在堆制后期，隨料中營養(yǎng)物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化，料溫下降，許多嗜熱或耐熱放線菌及霉菌在此營養(yǎng)和生態(tài)環(huán)境下開始大量繁殖[7]。后發(fā)酵大致可以分為4個階段：平衡溫度、巴氏殺菌、空氣調(diào)節(jié)和冷卻[8]。一方面通過巴氏殺菌殺死病蟲危害及其蟲卵和一些有害的微生物及孢子，另一方面通過空氣調(diào)節(jié)促進培養(yǎng)料進一步轉(zhuǎn)化為利于蘑菇菌絲吸收利用而競爭性雜菌不易利用的選擇性培養(yǎng)料[9]。

針對雙孢菇培養(yǎng)料工廠化制備的二次發(fā)酵過程中，微生物自動產(chǎn)熱，其中微生物及培養(yǎng)基理化性質(zhì)變化的研究目前很少見報道，本實驗監(jiān)測雙孢菇培養(yǎng)料二次發(fā)酵過程中的細菌、霉菌、放線菌的數(shù)量變化，包括物理感官特性、含水量、pH值、硝態(tài)氮含量這些理化指標(biāo)，為更全面了解在此過程中微生物對于培養(yǎng)基中底物的降解及產(chǎn)物生成的促進作用并通過微生物調(diào)控提高發(fā)酵效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雙孢菇培養(yǎng)料，取自山東省九發(fā)食用菌股份有限公司的培養(yǎng)料制備車間。培養(yǎng)料配方見表1。

表1 雙孢菇培養(yǎng)料成分Table1 Components of the Agaricus bisporus compost used in this study

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基用于細菌的培養(yǎng)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基用于霉菌的培養(yǎng)；高氏一號培養(yǎng)基用于放線菌的培養(yǎng)。

1.3 樣品編號及取樣時間

表2 雙孢菇培養(yǎng)料樣品編號及取樣時間Table2 Collection time points of Agaricus bisporus compost and corresponding numbers

1.4 雙孢菇培養(yǎng)料的采集

在每次倒料過程中分別每5～7鏟車取樣100g，使得能夠取到培養(yǎng)料堆各部位的樣品。取樣后放入液氮中速凍后于－80℃保存。

1.5 方法

1.5.1 細菌總數(shù)測定

參照GB/T 13093—1991《飼料中細菌總數(shù)的測定方法》進行測定。無菌稱取10.0g樣品，放入含有90mL無菌水的三角瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)先加有適量的玻璃珠)，200r/min振蕩30min，制成1:10的混勻稀釋液。吸取10-1稀釋液1mL，沿管壁慢慢注入含有9mL稀釋液的試管內(nèi)，混合均勻做成1:100的稀釋液。另取一支1mL滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋，如此依次稀釋。選擇3個適宜稀釋度，吸取該稀釋度的1mL稀釋液于固體培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，用涂布棒涂布均勻。細菌選擇10-5、10-6、10-7這3個稀釋度涂布，用NA培養(yǎng)基于適宜溫度下培養(yǎng)(表3)。計數(shù)，同時做3個平行。

表3 雙孢菇培養(yǎng)料的微生物培養(yǎng)溫度Table3 Culture temperatures of microbes from samples of Agaricus bisporus compost collected during fermentation

1.5.2 霉菌及放線菌總數(shù)測定

參照GB/T 13092—1991《飼料中霉菌的檢驗方法》進行測定。霉菌選擇10-1、10-2、10-3這3個稀釋度涂布于PDA培養(yǎng)基平皿，放線菌選擇10-3、10-4、10-5這3個稀釋度涂布于高氏一號培養(yǎng)基平皿，霉菌和放線菌的培養(yǎng)溫度見表3。

1.5.3 培養(yǎng)基的物理感官特征評定

每次取樣時，記錄培養(yǎng)基的氣味、顏色及韌度。其中氣味分為酸味、氨味、霉味及發(fā)酵香味4種，強度分為強、中、弱；顏色有棕黃、棕黑、青、白4種；韌性以秸稈能夠承受的最大拉力大小判斷，分為強、中、弱；蠟質(zhì)去除率以秸稈表面能夠直接被手捻掉的蠟質(zhì)面積占總表面積的比值計算。

1.5.4 含水量測定

參照GB/T 6435—2006《飼料中水分和其他揮發(fā)性物質(zhì)含量的測定》進行測定。按四分法取樣品5.00g，置于95～105℃干燥箱中，瓶蓋斜放于瓶邊，加熱(4±0.1)h，取出蓋好，放在干燥器中冷卻0.5h，稱其質(zhì)量。

式中：m1為稱樣皿和樣品的質(zhì)量；m2為稱樣皿和樣品干燥后的質(zhì)量；m為樣品的質(zhì)量。

1.5.5 pH值測定

參照王旭明等[10]的方法測定。準(zhǔn)確稱取樣品10.00g，加入100mL重蒸水中，充分混勻后靜置15min，過濾后測濾液的pH值。

1.5.6 硝態(tài)氮含量測定

參照GB/T 5009.33—2003《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》進行測定。采用鹽酸萘乙二胺法測定樣品中亞硝酸鹽的質(zhì)量，采用隔柱法測定樣品中硝酸鹽的質(zhì)量，亞硝酸鹽與硝酸鹽的質(zhì)量和即為培養(yǎng)料中硝態(tài)氮的質(zhì)量，計算培養(yǎng)料干質(zhì)量中的硝態(tài)氮質(zhì)量。

1.5.7 數(shù)據(jù)分析

每組測定做3個平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS統(tǒng)計軟件(SPSS 13.0)對測定數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)與多重比較分析，組間比較采用t檢驗，并用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢菇培養(yǎng)基中微生物的變化

雙孢菇培養(yǎng)基在工廠化制備過程中，即二次發(fā)酵期間細菌、霉菌及放線菌的數(shù)量變化如圖1所示。

圖1 發(fā)酵期間培養(yǎng)基中微生物數(shù)量的變化Fig.1 Changes in microbial numbers during fermentation of Agaricus bisporus compost

由圖1可見，細菌的數(shù)量最多，達到108數(shù)量級之上；其次是放線菌，達到105～106數(shù)量級；霉菌的數(shù)量最少，為102～103數(shù)量級。當(dāng)原料浴濕混勻后(f0)，微生物的數(shù)量最多，細菌總數(shù)為1.45×109CFU/g，放線菌總數(shù)為2.09×107CFU/g，霉菌總數(shù)為1.20×104CFU/g。進入前發(fā)酵階段后培養(yǎng)料的溫度上升至70～80℃，微生物數(shù)量下降，嗜熱微生物開始繁殖，其中細菌總數(shù)的下降程度最小，在第3次倒料時(f3)為1.50×108CFU/g；放線菌總數(shù)在第2次倒料時(f2)下降最多，為8.50×104CFU/g，隨后在第3次倒料時又增加到3.60×106CFU/g；霉菌總數(shù)在第2次倒料時下降為50CFU/g，在第3次倒料時又增加到100CFU/g。二次發(fā)酵期間(f1～f5)的微生物都是在50℃的高溫下培養(yǎng)的，為嗜熱微生物。第4次倒料(f4)時嗜熱細菌、放線菌及霉菌的數(shù)量都有所上升，分別為2.10×109、4.00×106CFU/g和1.50×103CFU/g。而經(jīng)過后發(fā)酵的巴氏殺菌過程，嗜熱的細菌和霉菌數(shù)量有所下降，分別變?yōu)?.20×108CFU/g和3.70×106CFU/g；而嗜熱霉菌的數(shù)量有所上升，為2.40×103CFU/g。

2.2 培養(yǎng)基的物理感官特征變化

雙孢菇的培養(yǎng)料在二次發(fā)酵期間物理感官特征的變化如表4所示。結(jié)果表明，在前發(fā)酵期間的高溫環(huán)境下，隨著微生物對于培養(yǎng)基中物質(zhì)的分解及培養(yǎng)基自身物質(zhì)的高溫化學(xué)反應(yīng)，使得酸味逐漸減小，氨味先增加后減少，當(dāng)前發(fā)酵結(jié)束時(f4)培養(yǎng)基中無酸味和氨味并產(chǎn)生了發(fā)酵的香味，后發(fā)酵結(jié)束時(f5)一些嗜熱霉菌的生長使得培養(yǎng)基的霉味增加。培養(yǎng)基的顏色由黃色逐漸地變?yōu)樽睾谏⑶译S著放線菌的生長使得培養(yǎng)基中白色的面積增加，后發(fā)酵結(jié)束后培養(yǎng)基中白色占總面積的60%。隨著發(fā)酵的進行培養(yǎng)基中秸稈的纖維被分解，能夠承受的拉力逐漸減小，并且蠟質(zhì)易去除率增加，到后發(fā)酵結(jié)束時達到60%，此時的麥秸纖維手捻可散。

表4 發(fā)酵期間培養(yǎng)基的物理感官特征變化Table4 Changes in physical and sensory characteristics during fermentation of Agaricus bisporus compost

2.3 培養(yǎng)基的化學(xué)成分變化

雙孢菇培養(yǎng)料在二次發(fā)酵期間的含水量、pH值及硝態(tài)氮含量的變化如表5所示。

表5 發(fā)酵期間培養(yǎng)基化學(xué)成分變化Table5 Changes in chemical characteristics during fermentation of Agaricus bisporus compost

由表5可見，在二次發(fā)酵過程中，含水量呈減少趨勢，由開始的76.8%顯著減少至64.8%(P≤0.05)。在前發(fā)酵期間，培養(yǎng)料為堿性，pH值先呈下降趨勢，由7.11降為7.03，但差異不顯著(P＞0.05)，第3次倒料時上升為7.68，與f0差異顯著(P≤0.05)，前發(fā)酵結(jié)束時(f4)又降為7.40，后發(fā)酵結(jié)束時又增為7.76。硝態(tài)氮含量先由原料浴濕后的35.62mg/kg顯著降低至第3次倒料時的4.23mg/kg(P≤0.05)，然后在第4次倒料時增加為18.77mg/kg，與f0差異顯著(P≤0.05)，后發(fā)酵結(jié)束時為14.41mg/kg。

3 討 論

工廠化制備雙孢菇培養(yǎng)基是一個非人工加熱而自產(chǎn)熱滅菌的二次發(fā)酵過程，通過嗜熱微生物的生長代謝和群落交替作用結(jié)合人工對于溫度的控制將培養(yǎng)基中的成分轉(zhuǎn)化為利于蘑菇吸收、利用的基質(zhì)[4]。前發(fā)酵過程中一些中溫性的微生物生長，利用原料中較為簡單的有機質(zhì)，產(chǎn)生熱量，料溫迅速上升，使得細菌、放線菌和霉菌的數(shù)量都有所降低，同時產(chǎn)生了有機酸使得培養(yǎng)料的pH值隨之下降并且有酸味。隨著料溫的繼續(xù)升高，嗜熱微生物開始大量繁殖，因此細菌、放線菌和霉菌的數(shù)量在第2次倒料后，開始呈上升趨勢，同時培養(yǎng)基中氨氣使得培養(yǎng)基的pH值開始升高并且培養(yǎng)料開始有刺鼻的氨味。另外由于微生物的降解作用，使培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮含量減少。同時，在高溫環(huán)境下，培養(yǎng)料中的碳水化合物發(fā)生焦糖化反應(yīng)使得培養(yǎng)基的顏色由黃色變?yōu)樽睾谏⑶译S著嗜熱放線菌的大量繁殖，培養(yǎng)基中呈白色的面積增加。

經(jīng)過后發(fā)酵的巴氏殺菌過程，細菌和放線菌的數(shù)量減少，霉菌的耐熱性較強，霉菌數(shù)量增加，因此培養(yǎng)基有霉味。由于高溫下水分的揮發(fā)，培養(yǎng)基的水分含量一直呈下降趨勢。細菌和真菌能夠降解木質(zhì)素[11]，因此經(jīng)過二次發(fā)酵后培養(yǎng)料中的秸稈用手捻即可散開。由于培養(yǎng)基中的氨化物被嗜熱放線菌固定，最終以富含氮的木質(zhì)素-腐殖質(zhì)復(fù)合體的形式存在[12]，因此后發(fā)酵結(jié)束時硝態(tài)氮的含量較前發(fā)酵期間顯著增加。

[1] 楊新美.中國食用菌栽培學(xué)[M].北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1988: 247.

[2] BEYER D M.Basic procedures forAgaricusmushroom growing[M].Philadelphia, Penn State: College of Agricultural Sciences Research,2003: 5-7.

[3] 嚴(yán)澤湘, 劉建先.蘑菇堆肥發(fā)酵新技術(shù)[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技, 2001,12(4): 35-37.

[4] 何麗鴻.雙孢蘑菇培養(yǎng)料二次發(fā)酵過程中的細菌群落結(jié)構(gòu)研究[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[5] STROM P F.Effect of temperature on bacterial species diversity in thermophilic solid-waste composting[J].Appl Environ Microbiol, 1985,50(4): 899-905.

[6] CHANG Y, HUDSON H J.The fungus of wheat straw compost , II.Biochemical and physiological studies[J].Trans Br Mycol Soc, 1967,50(4): 667-677.

[7] 姜成, 王澤生.蘑菇培養(yǎng)料堆制過程中微生物的演替及作用[J].微生物學(xué)雜志, 2003, 23(1): 56-58.

[8] de FEIJTER J, van NIEUWENHUIJZEN B.Small-scale mushroom cultivation-2:AgaricusandVolvariella[M].Wageningen, the Netherlands:Digiggrafi, 2007: 38-41.

[9] 孔祥君, 王澤生.中國蘑菇生產(chǎn)[M].北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 2000: 140-165.

[10] 王旭明, 倪永珍, 李維炯, 等.有效微生物群(EM)對飼料pH值及營養(yǎng)價值的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報: 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2002, 28(4):431-434.

[11] 曾光明, 黃國和, 袁興中, 等.堆肥環(huán)境生物與控制[M].北京: 科學(xué)出版社, 2006: 109-111.

[12] CHANG S T, QUIMIO T H.Tropical mushrooms: biological nature and cultivation methods[M].Hongkong: The Chinese University of Hongkong Press, 1982: 5-8.