藍莓葉總黃酮提取物的定性分析和抗油脂氧化

李穎暢，孫建華，孟憲軍

(1.渤海大學生物與食品科學學院，遼寧 錦州 121000；2.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161)

油脂在氧化過程中會形成大量的自由基，進一步分解生成醛、酮、醌、游離脂肪酸等有害物質，產生酸敗，從而降低其營養價值。油脂含量高的食品需添加抗氧化劑來防止脂肪氧化，目前常用的抗氧化劑均為人工合成，如BHA(丁基羥基茴香醚)、BHT(二丁基羥基甲苯)和PG(沒食子酸丙酯)，實驗證明人工合成抗氧化劑對人體有一定的毒副作用[1-3]，近年來上述化學合成抗氧化劑被發現有不同程度的累積致癌作用，目前BHT在美國和日本已被禁止使用，BHA在日本也已經禁用，以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品添加劑的發展趨勢。

藍莓，又稱越橘，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)多年生落葉或常綠灌木[4]。藍莓作為一種藥用植物，以葉入藥，性溫、味苦，有利尿、消炎、解毒之功效，并可用于風濕、痛風[5]。藍莓葉中含有豐富的黃酮類化合物，大量研究證明黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎癥等廣泛的生物活性[6-10]。我國有著豐富的藍莓資源，但對藍莓葉的加工利用極少，大部分當做廢棄物，造成資源浪費和環境污染。目前藍莓葉總黃酮的研究主要集中在提取和抗腫瘤等方面[11-12]，但作為油脂的抗氧化劑尚未見報道，研究開發高效、安全、保健的天然抗氧化劑，使其在食品工業得到廣泛應用具有重要意義。本實驗重點研究藍莓葉總黃酮抗油脂和脂質體氧化能力，旨在為進一步利用藍莓葉資源提供有益的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

藍莓葉總黃酮提取物：將藍莓葉(沈陽農業科技開發院藍莓種植基地提供) 50℃烘干，粉碎后過40目篩，用體積分數80%乙醇溶液按1:20(m/V) 50℃浸提2h后抽濾，收集濾液，濃縮，石油醚脫脂，AB-8大孔樹脂純化，40℃減壓濃縮，真空干燥得到黃色粉末，純度為78.04%[13]。

豬油：新鮮豬板油熬制。

無水乙醇 北京化學試劑公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、鹽酸 沈陽化學試劑廠；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫代巴比妥酸、抗壞血酸、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、蘆丁標準品(純度大于95.5%) 國藥集團化學試劑有限公司；大豆卵磷脂(生化試劑) 北京奧博星生物技術有限責任公司；BHT(食品級) 濟南世紀聯興經貿有限公司；HPD-600大孔樹脂 河北寶恩化工有限公司。

7200可見分光光度計 上海尤尼柯有限公司；UV-1600型紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；PHS-25型酸度計 上海理達儀器廠；電熱恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；RE-52型旋轉蒸發儀 上海博通經貿有限公司；SHZ-IIIB型循環水真空泵 上海華琦科學儀器有限公司；玻璃層析柱(1cm×30cm) 上海青浦滬西儀器廠；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏儀器設備有限公司；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；電熱鼓風干燥箱 天津實驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 藍莓葉提取物的定性檢驗

氨顯色反應、 鋁鹽反應、 鐵鹽反應參照文獻[14]進行測定。

藍莓葉總黃酮的紫外-可見吸收光譜：分別稱取一定量蘆丁標準品和藍莓葉總黃酮，用70%乙醇溶液溶解，定容至50mL容量瓶中，加質量分數5% NaNO2溶液1mL，放置6min后，加質量分數10%硝酸鋁溶液1mL，放置6min，再加質量分數4% NaOH溶液10mL，加去離子水至刻度，搖勻，放置15min，在波長400～800nm范圍內進行全波長掃描。

1.2.2 藍莓葉總黃酮抗豬油氧化性能研究

不同添加量藍莓葉總黃酮的抗豬油氧化性能研究：準確稱取一定量藍莓葉精制總黃酮、BHT，分別加入到50g豬油中，攪拌均勻。同時以不加添加物的豬油作空白。將所有樣品放置于(60±1)℃的干燥箱中，每隔一定時間攪拌一次，并交換它們在干燥箱中的位置。按照GB 5538—2005《油脂過氧化值測定方法》測定過氧化值(POV)，以POV大小表示油脂的氧化速度，POV值以每千克樣品中活性氧的毫摩爾數表示，進而衡量抗氧化劑的活性。

藍莓葉總黃酮與其他物質的協同抗氧化作用：選用抗壞血酸(VC)、檸檬酸為協同增效劑，與藍莓葉總黃酮在豬油中進行協同抗氧化實驗。

1.2.3 藍莓葉總黃酮抗脂質過氧化能力的測定[15-16]

1.2.3.1 試液的配制

脂質體PBS(磷酸緩沖液)分散系：300mg卵磷脂溶解于30mL 10mmol/L pH7.4 PBS(磷酸緩沖液)，用超聲波處理一定時間，周圍以冰水冷卻，制得人工脂質體。

三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-鹽酸(HCl)混合液：15g TCA、0.37g TBA、2.1mL濃鹽酸依次放入100mL水中。

1.2.3.2 測定步驟

分別于樣品管中依次加入1mL脂質體分散系、1mL 0.4mmol/L硫酸亞鐵、1mL樣品，混勻。避光于37℃水浴60min，加入2mL TCA-TBA-HCl混合液，90～100℃水浴15min，迅速冷卻，以3000r/min離心l0min，取上清液在波長535nm處測定吸光度(As)。對照管以1mL重蒸水代替1mL樣品，操作方法同樣品管，可測得對照管的吸光度(Ac)，參比管中以1mL重蒸水代替1mL卵磷脂，抗壞血酸為陽性對照。

式中：Ac為對照吸光度；As為藍莓葉總黃酮樣品吸光度。

2 結果與分析

2.1 黃酮類物質定性檢驗

氨顯色反應：將藍莓葉乙醇提取液滴于濾紙上風干，以揮發氨熏濾紙，立刻產生了深黃的顏色，當濾紙放置久后，因氨的揮發而褪色，這是黃酮類化合物的典型反應。

鋁鹽反應：向藍莓葉乙醇提取液中加入質量分數為1%三氯化鋁溶液，有一種黃色可溶性物質生成，可使溶液吸光度增大，說明有黃酮類物質存在。

鐵鹽反應：向藍莓葉乙醇提取液中加入氯化鐵溶液后，生成了墨綠色的沉淀， 放置一段時間之后溶液的顏色基本褪去，由此說明藍莓葉提取物中含有酚基。酚基是黃酮類化合物的官能團之一，故判斷藍莓葉提取物屬于黃酮類。

2.2 藍莓葉總黃酮的紫外-可見吸收光譜分析

按1.2.1節加入顯色劑，對藍莓葉總黃酮和蘆丁進行全波長掃描可知(圖1)，藍莓葉總黃酮和蘆丁的可見吸收光譜相一致，在波長400～800nm處有吸收，最大吸收波長為500nm，由此說明藍莓葉提取物中有蘆丁，屬于黃酮類物質。

圖1 藍莓葉總黃酮的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of flavonoids from blueberry leaves

2.3 不同添加量藍莓葉總黃酮對豬油的抗氧化作用

油脂暴露在空氣中易氧化形成自由基，自由基的鏈式反應使油脂繼續氧化。可以測定油脂的POV來評價其氧化程度，POV越高，氧化程度越高。由圖2可以看出，藍莓葉總黃酮對豬油有明顯的抗氧化作用，隨著藍莓葉總黃酮添加量的增加，其對豬油的抗氧化作用增強，時間越長，效果越顯著，添加質量分數0.4%精制總黃酮抗豬油氧化能力較強，略低于添加質量分數0.02%BHT。藍莓葉總黃酮抗豬油氧化性原因是黃酮類化合物作為還原體，失去氫離子，提供給氧化過程中的自由基，使其形成惰性化合物，從而終止豬油的氧化。藍莓葉總黃酮作為油脂的天然抗氧化劑是可行的，具有較好的開發應用前景。

圖2 不同添加量藍莓葉總黃酮抗豬油氧化性能Fig.2 Protecting effects of the refined folavonoid extract from blueberry leaves at different dosages against the lipid oxidation in lard

2.4 藍莓葉總黃酮與其他物質的協同抗豬油氧化作用

圖3 藍莓葉總黃酮與抗壞血酸、檸檬酸混合使用抗氧化性能的比較Fig.3 Synergistic protecting effects between ascorbic acid or citric acid and the extract against the lipid oxidation in lard

從圖3可以看出，添加質量分數0.1%藍莓葉總黃酮分別和0.05%檸檬酸、0.05%抗壞血酸合用的抗氧化性高于0.1%藍莓葉總黃酮的抗氧化性，低于0.02% BHT的抗氧化性。檸檬酸、抗壞血酸對藍莓葉總黃酮有協同增效作用，并且抗壞血酸的增效作用強于檸檬酸。檸檬酸對金屬離子有鰲合作用，形成金屬鹽，能促進氧化的微量金屬離子鈍化，不再具有催化能力，從而降低了油脂的氧化作用。抗壞血酸除具有一定的抗氧化作用外，還具有很強的還原性，可與油脂中的氧反應生成脫氫抗壞血酸，降低油脂中氧濃度，減緩自動氧化反應的速度；抗壞血酸的強還原性可使酚類抗氧化劑生成的酚氧自由基還原，使酚類抗氧化劑再生，抗氧化劑與抗壞血酸合用可充分地發揮其協同抗氧化作用。

2.5 藍莓葉總黃酮抗脂質過氧化能力

圖4 藍莓葉總黃酮對脂質過氧化的抑制作用Fig.4 Inhibition effects of the crude extract from blueberry leaves and its refined counterpart against the lipid peroxidation in soybean lecithin liposomes

由圖4可見，由Fe2+引發的卵磷脂脂質體體系中，藍莓葉總黃酮對脂質體有明顯的抑制作用，抑制率隨總黃酮質量濃度的增加而增大。不同質量濃度藍莓葉總黃酮對脂質體過氧化的抑制率差異顯著，精制總黃酮對脂質體的抑制作用明顯高于粗總黃酮。當精制總黃酮質量濃度為50μg/mL時，對脂質過氧化的抑制率為33.36%，當精制總黃酮的質量濃度為100μg/mL時，抑制率已達到83.36%，再增加精制總黃酮質量濃度時，對脂質過氧化的抑制率增長緩慢。藍莓葉總黃酮抗脂質過氧化能力明顯優于抗壞血酸(圖5)。精制總黃酮的IC50為67.46 μg/mL，粗黃酮的IC50為121.65μg/mL，抗壞血酸IC50為4.74mg/mL。

圖5 抗壞血酸對脂質過氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition effect of ascorbic acid against the lipid peroxidation in soybean lecithin liposomes

3 結 論

本實驗通過定性檢驗確定藍莓葉提取物的主要組分是總黃酮，并通過測定豬油的過氧化值和對脂質過氧化的抑制率研究藍莓葉總黃酮的抗油脂氧化能力。藍莓葉總黃酮具有抗豬油氧化能力，且有劑量效應關系，0.4%精制總黃酮抗豬油抗氧化能力較強，略次于0.02%BHT。抗壞血酸、檸檬酸對藍莓葉總黃酮均具有協同增效作用。藍莓葉總黃酮具有抗脂質體過氧化能力，隨著總黃酮溶液質量濃度逐漸增大，抑制能力逐漸增強，并且明顯優于抗壞血酸。藍莓葉精制總黃酮IC50為67.46 μg/mL，藍莓葉粗總黃酮的IC50為121.65μg/mL，抗壞血酸IC50為4.74mg/mL。

本實驗測定藍莓葉總黃酮抗氧化效果弱于合成抗氧化劑BHT，這可能與藍莓葉總黃酮的純度及其含有的總黃酮種類有關，若進一步提高藍莓葉黃酮純度，抗氧化性能將更強。研究和開發藍莓葉資源，使其總黃酮類物質成為合成抗氧化劑替代品，具有重要意義。

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