選擇性近紅外激光熱療對人肝癌細胞抑制作用的研究

曲華偉,張陽德,陳玉祥,趙勁風,王吉偉,何剪太

原發性肝癌是世界上最常見且惡性程度最高的腫瘤之一, 發病率在惡性腫瘤中位居世界第 5位,病死率位居第 3位[1]。傳統的手術治療、放療、化療等都不能對其徹底治愈。因此,研究探索新療法具有重要意義。近年來,隨著近紅外激光技術的研究進展,在近紅外激光水平上開展腫瘤熱療引起了人們的廣泛興趣。本研究通過觀察近紅外激光 (808 nm)誘導產熱對肝癌進行體內、體外的實驗研究,旨在為開辟新的有效的肝癌治療途徑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株及實驗動物 人肝癌 HepG2細胞,由中南大學湘雅醫院衛生部肝膽腸外科研究中心傳代培養。BALB/N裸鼠 56只,4～6周齡,22～25 g,雄性,飼養于中南大學動物學部層流動物房。

1.2 方法 體外實驗:(1)人肝癌 HepG2細胞貼壁生長48 h,熱療組分別按激光功率 1、2、3、4 W各照射 10 min,對照組 Hep G2細胞未照射,繼續培養 24 h,然后用苔盼藍染色后于倒置顯微鏡下拍照;(2)細胞接種于 96孔培養板中,培養 48 h后分別按不同功率近紅外激光 (1、2、3、4 W)照射 10 min,繼續培養,進行 MTT實驗;(3)腫瘤細胞傳代后制成單細胞懸液,接種于 24孔培養板中,并設對照組,近紅外激光按不同功率 (1、2、3、4 W)分別照射 10 min,24 h后收集細胞,接種于 96孔培養板中,每 24 h計算細胞數量,連續 4次。

體內實驗:將 30只移植性人肝癌裸鼠按隨機數字表法分為對照組和熱療組,熱療組又分為 1 W照射組、2 W照射組、3 W照射組和 4 W照射組,每組6只。各熱療組裸鼠分別給予不同功率近紅外激光照射10 min,每3 d照射 1次,觀察腫瘤的生長情況。8周后治療結束,處死裸鼠,剝離瘤體,觀察腫瘤體積變化。用蘇木素 -伊紅染色觀察對照組與各熱療組裸鼠移植瘤組織的病理變化。

1.3 觀察指標 體外實驗:激光熱療后細胞形態變化;MTT檢測激光對細胞增殖的影響;細胞計數觀察激光熱療對細胞數量的影響。體內實驗:觀察熱療后裸鼠移植瘤體積變化及其組織病理學改變。

1.4 統計學方法 采用 SPSS 10.0統計軟件包進行統計分析。計量資料用 (x±s)表示,采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人肝癌 Hep G2細胞體外實驗結果

2.1.1 近紅外激光熱療對肝癌 HepG2細胞形態的影響 對照組細胞形態規則,未見明顯細胞破裂及碎片 (見圖 1A)。熱療組細胞變形、壞死,細胞碎片逐漸增多,細胞貼壁減少(見圖 1B)。觀察近紅外激光照射區與非照射區可發現,右下方的照射區內細胞變形,碎片增多,貼壁減少,細胞壁損傷,苔盼藍染色;而左上方的非照射區細胞形態正常,貼壁良好,未被苔盼藍染色 (見圖1C)。近紅外激光照射范圍內細胞壞死明顯,范圍外細胞正常。兩者界限明顯,顯示近紅外激光具有顯著的選擇性 (見圖1D)。

2.1.2 近紅外激光熱療對肝癌 HepG2細胞增殖的影響 近紅外激光熱療對肝癌 Hep G2細胞增殖有顯著的抑制作用。且隨著激光熱療功率的增加,細胞抑制率也增加 (P＜0.05,見表1)。

2.1.3 近紅外激光熱療對肝癌 HepG2細胞生長抑制的影響不同功率近紅外激光誘導下,肝癌細胞株細胞生長數量較對照組顯著降低,差異有統計學意義 (P＜0.05,見表 2)。

2.2 近紅外激光熱療對肝癌裸鼠體內實驗結果

2.2.1 近紅外激光熱療對肝癌裸鼠腫瘤體積的影響 近紅外激光熱療組裸鼠移植瘤體積縮小,瘤體表面不光滑,可見壞死及焦痂形成。對照組移植瘤體積逐漸增大,表面光滑 (見圖2)。各熱療組裸鼠腫瘤體積與對照組比較,差異均有統計學意義 (P＜0.05,見表 3)。

2.2.2 肝癌裸鼠移植瘤組織近紅外激光照射前后組織病理變化 對照組腫瘤細胞生長良好,細胞分裂相多見。而熱療組裸鼠組織均出現不同程度的腫瘤壞死,壞死面積明顯高于對照組(見圖 3)。

表 1 不同功率近紅外激光熱療對 HepG2細胞作用的 MTT結果 (x±s)Table 1 MTT of thermal ablation with near-infrared laser of HepG2 cells

表 2 不同功率近紅外激光作用HepG2細胞不同時間時細胞生長數量(x±s,1×104)Table 2 Number of HepG2 cell by thermal ablation with near-infrared laser of cells

表 3 不同功率近紅外激光熱療對裸鼠腫瘤體積的抑制作用Table 3 Volumeinhibition of tumor after thermal ablation with near-infrared laser

圖 2 裸鼠成瘤及激光照射腫瘤變化Figure 2 Tumor by thermal ablation with near-infrared laser

圖 1 近紅外激光熱療對肝癌 HepG2細胞形態的影響Figur e 1 Effect of HepG2 cells change before and after thermal ablation with near-infrared laser

圖 3 裸鼠成瘤激光照射前后的組織病理變化Figur e 3 Pathology change of tumor tissue beforeand after thermal ablation with near-infrared laser

3 討論

原發性肝癌是世界上最常見且惡性程度最高的腫瘤之一,發病率在惡性腫瘤中位居世界第 5位,病死率位居第 3位。目前,肝癌治療首選手術切除。由于我國肝癌大部分伴有肝硬化或慢性肝炎,按大范圍的規則肝切除可導致并發癥的發生率及病死率增加[2]。而局部小范圍切除雖可以降低病死率,但往往導致腫瘤切除不徹底,術后復發率升高。而對于不能手術的肝癌患者目前較為常用的有聚焦超聲[3]、射頻[4]、微波、冷凍[5]等通過改變瘤內溫度而殺死腫瘤的方法。這些方法的共同點就是在肝臟內部形成一個規則的壞死區域,從而達到使腫瘤壞死的目的。以上治療方式都具有治療范圍外形規則的特點,當腫瘤臨近肝門區或下腔靜脈等重要器官時,治療顯得較為棘手,為降低手術風險往往避開這些區域,從而導致腫瘤切除不徹底,術后復發率升高。

本研究采用近紅外激光熱療治療肝癌的方法與以上治療方式不同。近紅外激光熱療的原理是利用激光產生熱效應和腫瘤不耐熱的特點對腫瘤進行治療,導致腫瘤凝固壞死,以達到滅活腫瘤和減少瘤負荷的目的[6]。近紅外激光照射可以根據腫瘤形狀的不同改變照射范圍,從而達到選擇性熱療的效果。正如圖 1C與圖 1D中所見,根據激光照射范圍的不同,壞死細胞與正常細胞之間界限明顯。可見,近紅外激光熱療具有選擇性特點。該治療方法選擇性較好,尤適用于那些腫瘤外形不規則,或臨近肝門區或下腔靜脈等重要器官的患者,從而徹底殺死腫瘤,降低術后復發率。

近年來,隨著納米技術的發展,在納米水平上研制納米磁性載體和藥物又引起了人們的廣泛關注。顏士巖等[7]研究的Fe2O3納米磁流體熱療治療肝癌就獲得了不錯的效果。但該研究也存在某些不足。首先,納米磁流體熱療溫度較低,最高至54℃,僅限于較低溫度誘導腫瘤的凋亡,并不能直接殺死腫瘤,也就不能達到根治的目的;其次,由于磁流體熱療溫度較低,其持續加熱時間較長 (60～90 min),高頻交變磁場照射的時間也就增加,對正常組織是否有毒副作用尚有待探討。本研究采用的選擇性近紅外激光熱療可直接殺死腫瘤組織。由于溫度較高,激光照射時間較短,對正常組織損害較小,是一種較為理想的選擇性熱療方式。本研究體外實驗結果顯示,經近紅外激光照射后,肝癌 HepG2細胞變性、壞死,且照射區壞死細胞與非照射區正常細胞界限明顯,說明近紅外激光有顯著的選擇性。經過近紅外激光照射后,Hep G2細胞增殖和細胞生長明顯受抑制,且激光功率越高,抑制率也越高。體內實驗結果顯示,近紅外激光照射后,肝癌裸鼠腫瘤體積較未照射的肝癌裸鼠顯著縮小,且激光功率越高,腫瘤體積抑制率也越高。

目前關于近紅外激光熱療治療腫瘤的研究國內尚未見報道。我們利用選擇性近紅外激光誘導產熱的特點,將其應用到腫瘤治療中,進行了一系列的體內體外實驗,為今后近紅外激光熱療應用于臨床積累了一定的實驗數據,初步驗證了該治療方法的可行性和有效性。

1 葉家才,崔書中,巴明臣.原發性肝癌的流行病學特征及其危險因素 [J].實用醫學雜志,2008,24(10):1839-1841.

2 張清華,劉景豐 .原發性肝癌治療進展 [J].醫學綜述,2008,14(10):1479-1481.

3 白晉,李發琪,杜永洪.高強度聚焦超聲形成生物學焦域的劑量學研究 [J].第三軍醫大學學報,2004,26(15):1378-1380.

4 張隆群,王濟明.射頻消融與手術切除治療肝癌并發癥及生存率的臨床對照研究 [J].第三軍醫大學學報,2007,29(5):457-459.

5 周霖,楊永平,劉靜.氬氦刀冷凍治療早期肝癌療效分析 [J].胃腸病學和肝病學雜志,2008,17(12):1000-1002.

6 Muralidharan V,Christophi C.Interstitial laser thermotherapy in the treatment of colorectal liver metastases[J].J Surg Oncol,2001,76(1):73-81.

7 顏士巖,張東生,鄭杰.Fe2O3納米磁流體熱療治療肝癌 [J].中華實驗外科雜志,2004,21(12):1443-1446.