需氧菌與厭氧菌混合感染致糖尿病足一例病原學檢測

陳麗丹,石玉玲,曾蘭蘭

1 病例簡介

患者,男,44歲,有糖尿病病史,因 “右下肢進展性紅腫、潰瘍、流膿、壞死伴疼痛 1月”入院。患者于 2009年8月 10日左右勞作中被鐵片刺傷,足跟部出現破潰,逐漸形成潰瘍,右足腫脹明顯,自行在社區診所清創,效果不佳,足跟處膿腫擴大,膿液較多,8月底紅腫逐漸向上蔓延,右下肢外側皮膚可見皺起、水皰、破潰伴有壞死表現,散發較濃重的腥臭味,疼痛加重。9月 2日于外院就診,入院時下肢紅斑腫脹仍未控制,繼續向上蔓延,皮膚表面出現黑色壞死,足底部潰瘍擠壓后可見大量氣泡溢出,體溫升高,診斷為 “右足外傷并產氣莢膜桿菌感染”,入院后給予 “頭孢他定、左氧氟沙星”抗感染治療,局部疼痛稍有緩解,但病情仍繼續發展,9月 16日轉入我院。查體發現右下肢腫脹明顯,右側足跟處可見一 3.5 cm×3.5 cm的潰瘍,邊界不清,有較多稀薄膿液流出,腥臭味明顯,擠壓后可見大量氣泡溢出。右大腿及小腿可見皮下氣腫,觸之可扣及捻發音,從足底至右側腰際部均可觸及.大腿外側可見大片糜爛,其上有 2～3處約 5 cm×5 cm的黑斑,右下肢觸痛明顯。入院后測餐后血糖為 30.8 mmol/L,給予胰島素靜脈滴注,次日清晨空腹血糖降為 10.0 mmol/L。請骨科、高壓氧科及普外科會診,會診后均考慮為 “氣性壞疽”,建議行手術治療。檢驗科細菌室床邊取材,在對傷口進行消毒后,將棉簽鉆入傷口取分泌物及時接種于厭氧血平板、普通血平板、皰肉培養基等,同時涂片。并取少許分泌物用于熒光PCR檢測。

2 病原學檢測方法

2.1 細菌培養 普通培養及厭氧培養同時進行,對厭氧培養菌進行兩次耐氧實驗確證為專性厭氧菌。需氧菌的鑒定采用法國梅里埃 VITEK-2 COMPECT全自動生化鑒定儀;厭氧菌的鑒定采用梅里埃的API20A鑒定條。

2.2 熒光 PCR (1)從臨床標本中提取 DNA,制備模板。 (2)探針序列為:5′-[FAM]TCATCATTCAACCAAAGGAGCAATCC[TAMRA]-3′, 引物 1序列為:5′-CGCATAACGTTGAAAGATGG-3′, 引物 2序列為:5′-CCTTGGTAGGCCGTTACCC-3′。(3)PCR體系:5 μl緩沖液;1μl dNTPs;引物 1、2各 1μl;0.6μl探針;0.2μl Taq酶及 2 μl細菌DNA模板,無菌雙蒸水補足體積 25μl。(4)Roche Light Cycler 480全自動熒光定量 PCR擴增儀,程序:95℃5 min,95℃ 15 s、55℃20 s、72℃20 s、在 55℃時采集熒光,重復 40個循環。陽性對照為產氣莢膜梭菌 ATCC13124;陰性對照為大腸埃希菌 ATCC25922,

3 檢測結果

3.1 革蘭染色結果 傷口分泌物涂片鏡檢可見大量革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌及白細胞。普通血平板培養分離到兩種陽性球菌,厭氧血平板培養可見多種細菌生長,分離純化并進行耐氧實驗 (即同時接種需氧及厭氧血平板)。最終分離到專性厭氧菌兩株,兼性需氧菌兩株,經過鑒定厭氧菌為多毛擬桿菌、消化鏈球菌;需氧菌為糞腸球菌和鳥腸球菌。

3.2 綜合分析儀器給出的各項數據,設定合理的閾值和基線 基線選取 2～6或3～7個循環,閾值線選在陰性擴增曲線的上方。儀器自動生成標準曲線,并計算出樣本的結果。若擴增曲線顯示有抬高,CT值 ＜36個循環,認為標本中產氣莢膜梭菌陽性;若擴增曲線無抬高或 CT值≥36個循環,認為標本中產氣莢膜梭菌陰性。本患者傷口棉拭子及傷口引流液檢測產氣莢膜梭菌均為陰性,陽性對照、陰性對照均在控。

4 討論

糖尿病足病理基礎是糖尿病的神經病變和血管病變,兩者和感染一起決定了糖尿病足病變的嚴重程度。而糖尿病足潰瘍的創面中,由于其滲出物中蛋白及糖的含量高,有利于細菌生長,極易合并感染,是導致壞疽,繼而致殘、致死的重要因素。5%～10%的糖尿病足患者需進行截肢手術[1]。氣性壞疽常由產氣莢膜梭菌等厭氧菌侵襲傷口,導致嚴重感染,以組織壞死、水腫產氣、全身中毒為特征,氣性壞疽的潛伏期從 8 h至 3周不等,但多為 1～4 d。傷口處皮膚開始為蒼白色,逐漸變成紅色或青銅色,周圍有明顯腫脹,觸診堅硬;局部可出現水皰,水皰液可澄清或為血色;傷口周面可捫及捻發音,擠壓可有惡臭氣體溢出,并有漿液樣血性分泌物流出。氣性壞疽的病原體分離:取患者的傷口滲出液或水皰液,進行革蘭染色,可見大量革蘭陽性桿菌,偶見極少量的白細胞。若出現大量白細胞則提示合并其他細菌感染[2]。

該患者傷口分泌物涂片可見大量白細胞,并可見大量陽性球菌及陰性桿菌,而未見革蘭陽性桿菌。盡管從臨床癥狀分析多數醫生考慮氣性壞疽,但病原學上并不支持該觀點。首先患者發病部位由足跟至腰部,發展時間已超過 1個月,若為產氣莢膜梭菌,其繁殖速度迅猛,若條件適宜(低氧化還原電勢或低酸堿度)感染可在1 d內蔓延至患者全身,引起休克甚至死亡。其次熒光定量 PCR靈敏度極高,只要標本中細菌含量超過 10 CFU均可被檢出,而本次檢測結果為產氣莢膜梭菌陰性,提示標本中不含有該菌。從患者傷口分離到的厭氧菌為多毛擬桿菌、消化鏈球菌;需氧菌為糞腸球菌、鳥腸球菌,提示該患者的足部潰爛是由多種需氧及厭氧菌混合感染所致。及時的抗菌治療和聯合用藥可減少截肢發生的可能性和病死率[3]。該患者在接受高壓氧及抗菌治療后已出院,在之后的隨訪中患者的病情有所好轉。

本病例提示多種細菌感染特別是混合厭氧菌感染時可同樣表現出皮下腫脹、腥臭味及捻發音。因而在臨床懷疑氣性壞疽時應行快速涂片查找陽性桿菌或熒光定量PCR快速檢測產氣莢膜梭菌,確實有病原學證據時再行相應處理,避免因誤診導致患者截肢。

1 胡仁明,朱禧明 .糖尿病 [M]//陳灝珠 .實用內科學 .12版 .北京:人民衛生出版社,2005:1015-1026.

2 陳軍,盧洪洲 .氣性壞疽的診斷與治療[J].診斷學理論與實踐,2009,8(1):111-113.

3 蔡健 .糖尿病足感染的細菌學與藥敏分析[J].疑難病雜志,2006,5(5):368.