康腦液 1號對大鼠腦缺血再灌注半暗帶細胞凋亡及Bcl-2/Bax比值的影響

薛 茜,鄒玉安,趙寶民,楊向方

腦缺血再灌注損傷導致的遲發性神經元損傷,主要與氧化應激反應、炎癥反應及細胞凋亡等有關。康腦液 1號為臨床治療缺血性腦血管病的經驗組方,臨床療效良好。藥理研究證實康腦液 1號組方中單藥如黃芪、三七、葛根等具有擴張血管、改善腦血流及微循環、降低血液黏度及血脂、抑制炎性反應等作用[1-4]。神經元凋亡是一種受基因調控的自主性、程序性細胞死亡過程,是腦缺血再灌注損傷的重要環節。Bcl-2/Bax比值與細胞凋亡調控有關。本研究通過觀察康腦液 1號對局灶性腦缺血再灌注后缺血半暗帶神經元凋亡和 Bcl-2/Bax比值的影響,探討其可能的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠180只,體質量 (270±20)g,SPF/UAF級,購自北京大學醫學部實驗動物科學部,許可證號:SCXK(京)2006-0008。稱重后隨機將大鼠分成 5組,每組 36只。 (1)假手術組;(2)模型組 (缺血再灌注組);(3)鹽酸法舒地爾注射液組;(4)康腦液 1號 A組;(5)康腦液 1號 B組。

1.2 藥物與試劑 康腦液 1號,由黃芪、三七等 8味中藥組成,由河北北方學院第一附屬醫院中藥房煎制。常規煎煮并濃縮至 4 g/ml。鹽酸法舒地爾注射液 (川威):天津紅日藥業股份有限公司生產 (國藥準字 H20040356;產品批號:060608;規格 2 ml:30 mg)。栓線購自北京沙東生物技術有限公司〔產品編號2432-100,線長40 mm,線身直徑 0.24 mm,頭端直徑 (0.32±0.02)mm〕。凋亡試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司 (產品批號:10090522)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備 康腦液 1號采用灌胃法,鹽酸法舒地爾注射液采用腹腔注射,均連續給藥 7 d,每天早晨給藥 1次,最后 1次給藥 1 h后實施腦缺血再灌注手術,術后繼續給藥至再灌注各時間點 (12、24、72 h);給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算,康腦液 1號 A組劑量為 1.5 g·100 g-1·d-1,B組劑量為 3.0 g·100 g-1·d-1。假手術組和模型組大鼠自手術日前 7天開始給予等量去離子水灌胃。采用改良 Longa法[5]復制大鼠大腦中動脈栓塞模型 (MCAO),大鼠用 7%水合氯醛 (350 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定于大鼠解剖板上;剪去頸右前部手術區的毛,碘酒消毒,鋪洞巾,于頸部行 15 mm旁正中縱行切口,并鈍性分離右側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈;用無損傷動脈夾夾閉頸總動脈近心端后,頸外動脈遠端結扎,靠近頸內、外分叉處約 5 mm剪一小切口,迅速將栓線插入頸內動脈直至有輕微阻力感為止,模型組、鹽酸法舒地爾組及康腦液1號 A、B組栓線插入深度為 (20.0±0.5)mm;假手術組麻醉同上,頸部切口暴露頸外動脈,不插線。實現大腦中動脈阻塞而致腦缺血;固定栓線去除動脈夾,栓線外留約 5 mm,逐層縫合;2 h后提拉栓線頭端退回至頸外動脈內,實現大腦中動脈再灌注,造模完成。動物清醒后觀察各組的活動度并采用 Longa評分標準進行神經功能評分 (0分:無神經功能缺損表現;1分:對側前爪不能充分伸展;2分:行走時向外側轉圈;3分:行走時向對側傾斜;4分:不能行走,意識喪失),1～3分者納入實驗,不符合模型判斷標準的動物剔除。假手術組未腦缺血,評分均為 0分;模型組、鹽酸法舒地爾組及康腦液 1號 A、B組手術均成功,均符合模型判斷標準,納入評分。

1.3.2 TTC染色及腦梗死體積測定 缺血 2 h再灌注24 h后,每組隨機抽取 6只大鼠,快速斷頭取出鼠腦,置冰箱(-20℃)內 10 min后,切除嗅腦,取冠狀面從前向后均勻切成 2 mm厚腦片 5～6片,將切片迅速置于 2%TTC溶液 (37℃水浴)中避光條件下染色 30 min。正常腦組織染成紅色,缺血區呈灰白色,界線清晰。4%多聚甲醛固定 24 h。數碼相機攝片,計算機圖像分析,求得 TTC染色兩側正常區與梗死灶的面積。以缺血對側腦片的面積減去缺血側 TTC染色正常區的面積求得腦梗死面積。

1.3.3 HE染色觀察病理形態 將實驗大鼠缺血 2 h,至再灌注所需時間點時,用 7%水合氯醛腹腔注射麻醉,常規灌注4%多聚甲醛 200 ml固定30 min。快速斷頭取腦,從前向后將腦組織分為 A、B、C、D、E 5等分,切成 2～3 mm厚的腦片,選取 C腦片,入 4%多聚甲醛固定液中繼續固定 24 h。常規乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚度 5μm,4℃儲存備用。

1.3.4 腦神經元凋亡檢測 采用末端脫氧核苷酸轉移酶(Td T)介導的地高辛 d UTP缺口末端標記法 (TUNEL)來識別凋亡細胞。

1.3.5 Bcl-2/Bax比值測定 采用 SP法進行檢測,陰性對照用 0.01 mol/L PBS(p H 7.4)代替一抗。嚴格按說明書進行操作,DAB顯色,常規脫水、透明、封片。抗體及試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司 (PV-6001,批號:K92708D)。抗體稀釋液:ZL1-9029,批號:546892A。

1.4 統計學方法 所有數據以 (x±s)表示,采用 SPSS 16.0軟件包進行統計學處理。多組間均值的比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經行為學評分及腦梗死體積 大鼠 MCAO術后多于1.5 h內清醒。假手術組大鼠活動度大。模型組大鼠術后精神較差,反應遲鈍,蜷縮扎堆,24 h后仍然有蜷縮扎堆現象。康腦液 1號組和鹽酸法舒地爾組的大鼠狀態有一定好轉,活動度較大,無蜷縮扎堆現象。術后 24 h康腦液 1號組和鹽酸法舒地爾組 Longa評分低于模型組,差異有統計學意義 (P＜0.01,見表1)。缺血再灌注6 h即可看到明顯梗死灶,累及右側大腦半球基底核區、額頂葉皮質及海馬區,隨再灌流時間的延長梗死面積逐漸增大,至缺血再灌注 24 h時,模型組梗死面積為 (43.00±0.68)%,康腦液 1號 A、B組分別為(35.20±0.55)%、(35.00±0.37)%。康腦液 1號 A、B組與模型組相比梗死面積明顯減小,差異有統計學意義 (P＜0.05)。

表 1 各組大鼠神經功能行為學評分比較 (x±s,分)Table 1 Comparison of the neuralogical function score

2.2 組織病理學改變 高倍光鏡下觀察。(1)假手術組:大腦組織結構完整,無梗死灶及水腫。神經元、神經膠質細胞未見異常。細胞膜、核膜清晰,核仁明顯。 (2)模型組:缺血第 1天,缺血對側,細胞形態正常,核仁清楚。缺血側皮質神經元數量明顯減少,排列紊亂,組織間隙水腫嚴重。缺血半暗帶明顯,神經元稍小,形態基本正常;缺血灶中心區神經元體積明顯縮小,部分細胞呈三角形,膠質細胞固縮。缺血第 7～14天神經元、膠質細胞、毛細血管、小血管與周圍腦間質的間隙顯著增大,間質疏松。病灶中心區隨時間延長出現大量液化性壞死灶及囊性變,后期呈網狀改變,殘存細胞很少。(3)康腦液 1號 A組和 B組及鹽酸法舒地爾組:在各個時間點與模型組相比,神經元形態改變較輕,細胞體完整,突起較清楚,基本保持完整。可見尚存的大腦皮質的正常神經元排列結構,且組織間隙水腫較模型組明顯減輕,神經元、膠質細胞和血管大量變性壞死等缺血性改變和炎性反應明顯輕于模型組。

2.3 康腦液 1號對大鼠腦缺血半暗帶神經元凋亡及 Bax/Bcl-2比值的影響 光鏡下 (×400)細胞核內存在棕黃色顆粒者為凋亡細胞。在梗死周邊區隨機選取 10個互不重疊視野,計數陽性細胞數。各時間點模型組細胞凋亡數及 Bcl-2/Bax比值明顯高于假手術組 (P＜0.05);與模型組比較,康腦液 1號 A組和 B組、鹽酸法舒地爾組細胞凋亡數目減少 (P＜0.05),而 Bcl-2/Bax比值升高 (P＜0.05,見表 2、3)。

表 2 各組大鼠缺血半暗帶神經元凋亡數目比較 (x±s)Table 2 Comparison of the numbers of the neuronal apoptosis cells around the necrotic area in rats

表 3 康腦液 1號對缺血再灌注大鼠缺血半暗帶 Bcl-2/Bax比值的影響(x±s)Table 3 The effectsof kangnao ye 1 on the Bcl-2/Bax ratio after the focal cerebral ischemia-reperfusion around the necrotic area in rats

3 討論

近年來,關于中藥復方治療腦卒中的研究進展迅速。康腦液 1號中黃芪為君藥,三七、葛根、天麻、川芎共為臣藥,佐以鉤藤、地龍,同時川芎、地龍又具引藥之性,二藥輕清引上,直達病所。黃芪益氣升陽,三七活血止血[6],鉤藤熄風鎮驚,地龍清熱利濕,天麻、川芎定風[7]。對腦缺血損傷的神經保護作用的機制可能為多水平、多通道、多靶點的綜合效應。

研究表明,缺血半暗帶的細胞凋亡與疾病轉歸相關。細胞凋亡是細胞為維持其內穩態的自主程序性死亡 (programmed cell death,PCD)。抑制缺血后神經元凋亡對保護神經元具有重要意義。細胞凋亡的機制與凋亡基因表達有關,即促凋亡基因和抗凋亡基因。Bcl-2、Bax基因是目前研究較明確的一對在功能上相互對立的凋亡調控基因。

Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡調控蛋白,主要分布于線粒體、內質網和細胞核的外膜[8]。Bcl-2蛋白家族根據其作用分為 2類:一類為抗凋亡蛋白,如 Bcl-2蛋白;另一類為促凋亡蛋白,如 Bax蛋白。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間相互拮抗。Bcl-2蛋白能夠抑制 Bax蛋白啟動凋亡機制。而 Bax蛋白作為 Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員,可以不依賴于激活或抑制其他相關基因而誘導細胞凋亡。細胞是否進入凋亡程序決定于 Bcl-2蛋白和 Bax蛋白的相對值,Bcl-2/Bax的比值改變與神經元凋亡密切相關[9]。

以往研究顯示腦缺血后促凋亡蛋白 Bax表達明顯增加,且Bax陽性反應位于 TUNEL陽性的細胞內,其時程與空間的分布與 TUNEL陽性神經元一致[10]。Bcl-2/Bax比值的改變可能調控了神經元的凋亡。研究表明,細胞受刺激后 Bcl-2/Bax比值越高,細胞存活率越高,細胞凋亡率越低。

本研究結果發現缺血再灌注后大鼠神經元凋亡數目、Bcl-2/bax比值均明顯高于假手術組;Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾注射液對腦缺血再灌注具有很好的改善作用[11-12],可降低凋亡率,升高 Bcl-2/Bax比值。本研究顯示,康腦液 1號A組和 B組可上調腦缺血再灌注誘導的 Bcl-2蛋白表達,同時下調 Bax蛋白表達,使 Bcl-2/Bax比值升高,可能促使 Bax-Bcl-2異源二聚體形成,抑制細胞凋亡。康腦液 1號 A組和 B組不同劑量給藥對大鼠神經元凋亡數目、Bcl-2/bax比值的影響無顯著性差異,符合臨床中醫中藥辨證論治理論。中藥組方中各單味中藥之間的比例是關鍵,而中藥組方的總劑量對治療無決定性作用。經康腦液 1號治療后,梗死灶明顯減小,腦神經元凋亡減少,Bcl-2/Bax比值明顯高于缺血再灌注組,說明康腦液 1號可能通過抑制腦神經元凋亡,達到保護缺血半暗帶目的,從而起到保護大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的作用。

綜上所述,康腦液 1號可明顯減少 MCAO大鼠缺血半暗帶神經元凋亡,其機制可能與提高 Bcl-2/Bax比值有關,這可能是其促進神經元修復及重塑的機制之一。為臨床應用康腦液 1號治療缺血性腦血管疾病提供了一定的實驗依據。

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