回神顆粒對急性腦梗死大鼠長時程增強的影響

龐 瑩，韓大東，楊 卓，陳寶貴

300071 南開大學醫學院（韓大東，楊 卓）

301700 天津市武清區中醫醫院（陳寶貴）

腦卒中是嚴重危害人類健康和生命安全的常見的難治性疾病，中醫學將其列為“風、癆、臌、膈”4大疑難病之首，存在著明顯三高（發病率高、致殘率高、病死率高）現象。腦卒中又以缺血性中風為多，急性腦缺血后常有相應的運動、感覺、知覺以及學習記憶障礙，其中學習記憶障礙最為常見持久。回神顆粒是導師陳寶貴教授在長期臨床實踐中，在不斷總結用藥經驗基礎上研制而成，是治療腦缺血的有效中藥復方制劑，具有良好的腦神經細胞保護作用。在前期行為學實驗中，已經證明回神顆粒可以提高大鼠智力，增強學習記憶能力[1]，本次研究擬進一步證實其提高大鼠學習記憶能力的作用機制。

1973年，Bliss和他的同事在兔海馬中發現一種高頻刺激誘發的長達數小時的突觸傳遞增強，即長時程增強（LTP）[2]，LTP被認為是神經突觸傳遞和可塑性的一種表現形式[3]。在中樞神經系統中，海馬是與學習記憶、情緒和行為功能密切相關的重要腦區，其突觸可塑性和傳遞增強則與學習記憶功能密切相關，大量的研究證實LTP與記憶形成的分子機制有高度的一致性，LTP已被廣泛地認為是研究記憶的最佳細胞模型[3]。本研究就從觀察大鼠海馬LTP的變化來闡述回神顆粒改善學習記憶能力的機制。

1 材料和方法

1.1 材料 PowerLab，澳大利亞ADInstruments公司；頭部立體定位儀，日本Narishige；回神顆粒，天津武清中醫醫院生產。

1.2 分組、建模與給藥 48只健康雄性Wistar大鼠，體質量250～320g，由軍事醫學科學院提供。隨機分為模型組、對照組、藥物組，各組再分成1 d、3 d、7 d 3個亞組，每個亞組8只。

缺血模型大鼠參照Zea-Longa線拴法復制大腦中動脈缺血模型（MCAO）。大鼠用10%水合氯醛（0.9 mL/250g）腹腔注射麻醉，暴露出左側頸總動脈和分叉部，分離動脈分叉處的頸內動脈和頸外動脈，將頸外動脈近心端結扎，將預先準備好的直徑為0.235 mm、長約5 cm、前端加熱成圓形的漁線，用肝素浸泡后插入頸內動脈，直至有阻力時，即阻斷大腦中動脈（MCA）入口處，清潔縫合傷口。

待大鼠清醒后按Zausinger六分法對其神經功能進行評分。0分，不能自發行走；1分，自由走動狀態下向病變對側旋轉；2分，抓住鼠尾，大鼠向病變對側旋轉；3分，對于施向病變對側的側壓力抵抗力下降者；4分，不能伸直病變對側前爪，甚至全身向對側屈曲；5分，無神經功能缺損。剔除5分者。

藥物組大鼠待建模結束、清醒、評分后，灌胃給藥，從建模第一天起連續每日給藥至測LTP，0.7g/（kg·d）。

1.3 電生理學 實驗大鼠予30%烏拉坦（1.2g/kg）麻醉，固定于頭部立體定位儀，檢測海馬內嗅區前穿通纖維（PP）和海馬齒狀回（DG）之間長時程增強（LTP）。依據Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜（1986年），記錄LTP時，置于PP的刺激電極為前囟后7.8～8 mm，中線旁4～4.5 mm；置于DG的記錄電極位于前囟后3～3.8 mm，中線旁1.5～2.5 mm。用比較接近生理變化的theta頻率刺激（TBS）誘導出LTP。記錄電極和刺激電極均緩慢插入，直到選一固定強度并能記錄出最大群體峰電位（PS）的部位。檢測刺激為單個方波，波寬0.1 ms，選取能誘發最大PS幅度1/2～1/3的強度。記錄20 min低頻（0.1 Hz，波寬0.1 ms）誘導的反應作為基礎值，再給予高頻刺激（6個5 Hz的串刺激，每個串刺激有5個頻率為100 Hz的單脈沖，TBS重復10次，每次間隔20 s）誘導LTP。記錄并保存刺激前20 min至刺激后2 h的反應，分析興奮性突觸后電位（EPSP）的斜率和PS的幅值。

1.4 數據分析 排除沒有引出波形大鼠和過高或過低數值，每組有5只大鼠進入數據分析。實驗結果以平均數±標準差（±s）表示，組間差異采用方差分析。

2 結果

2.1 神經功能評分 大鼠建模清醒后進行第一次評分，之后隨機入組，經統計各組大鼠評分差異無統計學意義，具有可比性見表1。之后每天給藥前予以評分，各組大鼠在測LTP之前進行最后一次評分，模型組評分均有所下降，藥物3 d組和藥物7 d組評分增高，經統計藥物7 d組與模型7 d組的差異有統計學意義，見表2。

表1 各組大鼠建模后第一次神經功能評分比較（±s）

表1 各組大鼠建模后第一次神經功能評分比較（±s）

組別模型組藥物組n55 1 d 1.875±0.8345 1.500±0.5477 3 d 2.000 0±0.500 0 1.833 3±0.752 8 7 d 1.833 3±0.408 2 2.000 0±0.707 1

表2 各組大鼠LTP前最后一次神經功能評分比較（±s）

表2 各組大鼠LTP前最后一次神經功能評分比較（±s）

注：①與模型7d組比較，P<0.05。

組別模型組藥物組n55 1 d 1.750 0±0.707 1 1.666 7±0.516 4 3 d 1.888 9±0.333 3 2.333 3±0.816 5 7 d 1.666 7±0.516 4 2.400 0±0.547 7①

2.2 LTP

2.2.1 興奮性突觸后電位（EPSP）的斜率 各組大鼠均能誘導出LTP，各個亞組中對照組與模型組的EPSP斜率的差異都有統計學意義（1 d組P<0.05，3 d組與7 d組P<0.01）。1 d組中，藥物組的EPSP斜率高于模型組，但差異無統計學意義，見圖1。隨著治療時間的延長，藥物組EPSP斜率呈現增高趨勢，7 d時明顯高于1 d；而模型組基本無變化；兩組相比差異有統計學意義（3 d組P<0.05，7 d組P<0.01；見圖 2、圖 3）。

圖1 1d組高頻刺激（HFS）后EPSP斜率的比較

圖2 3d組高頻刺激（HFS）后EPSP斜率的比較

圖3 7d組高頻刺激（HFS）后EPSP斜率的比較

2.2.2 PS幅值 模型組與對照組的PS幅值相比差異有統計學意義（1 d、3 d、7 d組均為 P<0.01）。隨著天數的增加，模型組與藥物組的PS幅值均有所增高，但藥物組增幅高于模型組（1 d組P<0.05，3 d組與7 d組P<0.01）。（如圖4、圖5、圖 6所示）

3 討論

圖4 1d組高頻刺激（HFS）后PS幅值的比較

圖5 3d組高頻刺激（HFS）后PS幅值的比較

圖6 7d組高頻刺激（HFS）后PS幅值的比較

急性腦卒中時神經系統的一些連接被破壞，其恢復是一個重新建立信號連接的過程。為調節各種適應性反應，神經系統的回路在整個生活過程中都是可變、修飾或稱為可塑的，它可影響神經系統的生長發育、神經的損傷和修復及學習記憶多種腦功能，而突觸連接變化是學習記憶的神經基礎[4]。腦的可塑性包括所有神經功能重組的可能機制：復原功能上相同而未損通路，突觸發生，樹突發芽，強化現有的但功能沉默的突觸連接，促進梗死區周圍LTP，生存的神經細胞的纖維發芽等。LTP現象被認為反映了突觸水平的記憶過程,一些損害學習記憶的因素可減低或阻斷LTP的形成,而易化LTP的因素或藥物能提高動物的學習記憶能力[5]。LTP的形成機制十分復雜，其中心環節是細胞內Ca2+濃度升高以及由此引發的下游生化事件，如蛋白激酶活化、N-甲基-D天門冬氨酸受體 (興奮性神經遞質受體)表達增多等[6]。Sopala等[7]研究表明短暫的大腦中動脈閉塞導致病灶同側的海馬腦片誘導LTP的僵直刺激只產生短暫的增強，在1h內恢復到僵直前水平，表明短暫的大腦中動脈閉塞導致病灶同側的海馬功能障礙。

回神顆粒由人參、石菖蒲、鹿角、靈芝、丹參、五味子、川芎等藥物組成，在治療創傷性腦損傷、腦梗死[8]、腦出血[9]、各種癡呆等[10]神經疾病方面都取得了良好的療效。本文記錄了通過灌服回神顆粒治療的急性腦梗死大鼠內嗅區前穿通纖維-海馬齒狀回（PP-DG）的LTP，PS幅值和EPSP斜率增大都反映了突觸后細胞同步活動的增強，這些電生理指標的改變必然會影響突觸后神經元的動作電位的產生，影響學習記憶等高級神經反射活動。結合同時期的大鼠神經功能評分，結果發現大鼠PP-DG的LTP效應強度與大鼠神經功能評分的改善是平行的。

筆者的研究表明，回神顆粒能改善大鼠腦缺血后神經功能的缺損，糾正由永久性大腦中動脈閉塞引起的缺血同側海馬DG區基本的突觸傳遞降低和單脈沖刺激海馬穿通纖維引起的齒狀回顆粒細胞的共同發放幅度的降低，消除缺血對缺血同側海馬DG區突觸傳遞造成的損害，可以提高由于缺血造成的海馬DG區LTP的幅度，并能提高其斜率。筆者認為，回神顆粒通過提高缺血后突觸傳遞的效率來促進腦缺血后突觸可塑性的形成，進而影響腦缺血后大腦功能的重組。

突觸可塑性依賴于不同突觸前、突觸后神經元機制和突觸周圍的膠質細胞[11]，本實驗研究雖然提示回神顆粒影響了LTP誘導和維持，但尚不能揭示其影響LTP的機制，這是值得進一步研究的課題。

[1]陳寶貴，趙振發，呂培紅，等.回神丹顆粒劑對大鼠智能障礙行為的影響[J].中國醫藥學報，1998，13(2):73-74.

[2]Bliss TVP,Collingridge GL.A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus[J].Nature,1993,361:749.

[3]Markevich V,Scorrsa AM,Dawe GS,et al.Cholinergic facilitation and inhibition of long-term potentiation of CA1 in the urethane-anaesthetized rats[J].Brain Res,1997,754(1-2):95.

[4]Boniface SJ,Ziemann U.Plasticity in the Human Nervous System.Investigations with Transcranial Magnetic Stimulation[J].Brain(S0006-8950),2004,127(5):1212-1213.

[5]Bliss TV P,Collingridge G L.A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus[J].Nature,1993,361:31.

[6]Kullmann DM,Asztely F,WalkerMC.The role of mammalian ionotropic receptors in synaptic plasticity:LTP,LDP and epilepsy[J].CellMol Life Sci,2000，57:15512611.

[7]Sopala M,Frankiewicz T,Parsons C.Middle cerebral artery occlusion produces secondary,remote impairment in hippocampal plasticity of rats-involvement of N-methyl-D-aspartate receptors[J].Neuroscience Letters,2000,281:143-146.

[8]陳寶貴，趙振發，卞景芝，等.回神顆粒對實驗性大鼠局灶性腦缺血缺血區神經細胞凋亡的影響[J].天津中醫藥，2006，23（3）：227-230.

[9]陳慧媧，劉海東，陳寶貴.回神顆粒治療急性高血壓腦出血的療效觀察[J].天津中醫藥，2005，22（4）：330.

[10]崔俊波，陳慧媧，李洪艷，等.回神顆粒治療血管性癡呆臨床療效觀察[J].時珍國醫國藥，2007，18（9）：2166-2167.

[11]Slezak M，Pfrieger FW，Soltys Z.Synaptic plasticity astrocytes and morphological homeostasis[J].J Physiol，2006，99：84-91.