大黃與活血、止血藥配伍調控小鼠腹腔巨噬細胞增殖活性的研究*

李繼坤，張艷萍，王 倩，薛小平，楊秀竹

（天津市中西醫結合急腹癥研究所，天津 300100）

復方中藥是中醫辨證施治的具體體現和實施方式，被認為是中醫用藥的精髓之一[1]。由于中藥藥效成分復雜，以及中藥的多層次多靶點作用的特點,導致復方藥物研究存在諸多難點[2-3]。雖然近年來中藥配伍研究取得長足進步[3-4]，但是中藥配伍之間的相互作用的篩查仍是一項浩繁的系統工程，目前還沒有理想的實驗方法。噻唑藍比色分析方法（MCA）是一種簡單準確、快捷的測定細胞活性的方法，廣泛應用在細胞學研究領域[5]。本實驗選用MCA測定方法對大黃與丹參、復方丹參、白及配伍對小鼠腹腔巨噬細胞增殖活性進行了初步實驗研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料 動物：清潔級Balb/c小鼠，雌雄兼用（軍科院實驗動物中心提供）。主要試劑：DMEM營養液，胎牛血清（Life Technologies，Inc.）；硫基乙醇酸鹽（中國藥品生物制品檢定所）；噻唑藍（MTT）、L－谷胺酰胺（GIBCO產品）。主要儀器：二氧化碳孵育箱（series 5400美國NAP－CO）；全自動酶標儀（2010型，奧地利TECAN公司）；細胞培養用顯微鏡（CK400）。實驗用藥：大黃水煎劑、白及水煎劑（由天津市中西醫結合急腹癥研究所藥物研究室提供，每毫升相當于生藥1 g）；丹參粉針劑（哈藥集團中藥二廠提供。國藥準字：Z10970093；批號：070123；400 g/L）；復方丹參注射劑（上海第九制藥廠提供，國藥準字：Z13021388；批號：070512；每毫升相當于生藥 2 g）。

1.2 實驗藥物配制及分組 大黃及白及水煎劑用0.22濾膜過濾除菌，選用營養液配成3種濃度（高濃度為：100 g/L；中濃度為：10 g/L；低濃度為：1 g/L）的應用藥液備用。丹參粉針劑（高濃度為：400 g/L；中濃度為：4 g/L；低濃度為：4 g/L）、復方丹參注射劑（高濃度為：200 g/L；中濃度為：20 g/L；低濃度為：2 g/L）兩種藥物同樣用營養液配制備用，調pH值至7.2～7.4之間。

實驗分組：A組：大黃水煎劑組；B組：白及水煎劑組；C組：丹參粉針劑組；D組：復方丹參注射劑組；E 組：大黃水煎劑加白及水煎劑組（1∶1）；F 組：大黃水煎劑加丹參粉針劑組（1∶1）；G組：大黃水煎劑加復方丹參注射劑組（1∶1）；巨噬細胞對照組；共8組。每組藥物均為3個濃度。

1.3 實驗方法 小鼠腹腔巨噬細胞的分離純化和培養：用3%硫基乙醇酸鹽（TG）0.5 mL注入小鼠腹腔內（每次實驗8只），誘導腹腔巨噬細胞聚集，48 h后，斷頸處死。用75%乙醇浸泡1～2 min，固定于解剖臺上。用眼科剪刀在下腹部皮膚做V字切口，向上剝離皮膚，而后向腹腔內注入堿性磷酸鹽緩沖液（PBS），5 mL，輕揉腹壁后，抽出腹腔液體放置離心管中。以1500 r/min速度離心10 min，棄上清液，加入DMEM培養液10mL重新懸浮細胞，再用1500r/min速度離心10 min，棄上清液。沉淀的細胞用含10%胎牛血清的DMEM營養液懸浮細胞，加入培養瓶中，置5%二氧化碳（CO2）、37℃培養箱中孵育2 h后，輕搖培養瓶棄除未貼壁的細胞。重新用10%胎牛血清的DMEM營養液懸浮貼壁細胞，臺酚蘭染色計數細胞成活率大于95%則可使用，調細胞濃度至 1×109個/L備用。

1.4 實驗步驟 將濃度為1×109個/L的巨噬細胞懸液0.18 mL接種于96孔板各孔中培養，24 h后細胞處于增殖期，將各種藥物0.02 mL分別加入96孔板各孔中，每組做6個平行孔。放入5%CO2孵育箱中培養，分別于24、72、120 h測定細胞活性。培養結束前 4 h 摻入 MTT（5 g/L）20 μL 繼續培養，培養結束后棄上清液，加入1∶300鹽酸-異丙醇溶液100 μL,置微量振蕩器振蕩10 min，用2010型全自動酶標儀于620 nm測定OD值。

1.5 統計學方法 采用Untitled-SPSS 13.0統計軟件，所有實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較應用單因素方差分析做統計學處理，P<0.05表有顯著性異。

2 結果

丹參粉針劑高濃度、中濃度、低濃度對腹腔巨噬細胞活性有促進作用；而隨著時間的延長促進作用逐漸消失。復方丹參注射液只有高濃度對腹腔巨噬細胞活性有促進作用。白及中濃度在24 h對腹腔巨噬細胞活性有抑制作用P<0.01。見圖1。

大黃水煎劑加白及水煎劑組高濃度、中濃度、對腹腔巨噬細胞活性有抑制作用；而中濃度隨著時間的延長抑制作用逐漸消失。大黃水煎劑加丹參粉針劑組高濃度、中濃度、低濃度對腹腔巨噬細胞活性有促進作用。大黃水煎劑加復方丹參注射劑組僅高濃度、中濃度24 h時對其有促進作用。見圖2。

各組間相比，大黃水煎劑加丹參粉針劑組對腹腔巨噬細胞活性的促進作用效果最好；大黃水煎劑加白及水煎劑組對腹腔巨噬細胞活性具有抑制作用。實驗結果表明：大黃與不同的藥物結成藥對可以產生顯著不同的效果。見表1。

表1 大黃與白及、丹參粉針劑、復方丹參配伍對小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響(±s)Tab.1 Effect of rhubarb combined with Bletilla striata,salvia miltiorrhiza,compound salvia miltiorrbiza on the activity of peritoneal macrophage cell(±s)

表1 大黃與白及、丹參粉針劑、復方丹參配伍對小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響(±s)Tab.1 Effect of rhubarb combined with Bletilla striata,salvia miltiorrhiza,compound salvia miltiorrbiza on the activity of peritoneal macrophage cell(±s)

注：與對照組比較（抑制），誗P<0.01；與對照組比較（抑制），#P<0.05；與對照組比較（促進），★P<0.01；與對照組比較（促進），*P<0.05。

組別高劑量組中劑量組低劑量組對照組n6666大黃與白及161.50±43.3誗218.83±84.29#335.66±39.89337.16±21.42大黃與丹參589.16±42.14★547.66±61.19★387.83±36.56*350.83±14.93大黃與復方丹參577.00±17.88★441.16±84.29★356.50±68.49350.83±14.93

3 討論

中藥配伍規律是中醫藥理論的精華之一，開展中藥配伍研究對繼承和發展中醫藥理論，具有重要的理論意義。方劑的配伍規律一直是古今醫家苦苦探尋的焦點，也是近年來方劑研究的重點課題。活血與清下藥物配伍治療腹部疾病的臨床和基礎研究取得重大進展[4]。本實驗選取其中的清下要藥大黃、活血藥物丹參、并選擇止血藥白及進行配對研究。探討藥對的協同增效作用。實驗結果表明大黃與不同的藥物結成藥對可以產生顯著不同的效果。此為中藥配伍用藥提供了實驗數據。

大黃具有瀉下攻積、瀉火解毒、活血祛瘀、利膽退黃等功效，因其療效卓著、歷代沿用不衰。特別是許多醫家精于配伍變化，拓寬了大黃的適應范圍，積累了豐富的用藥經驗[2]。丹參具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩等功效，臨床廣泛用于活血化瘀、消炎和心腦血管疾患等癥，是國內外現代化中藥研究的熱點品種之一。復方丹參注射液是由丹參和降香組成,降香功能為行氣止痛，活血止血等功效。本實驗結果顯示大黃與丹參、復方丹參配伍能夠協同增強小鼠腹腔巨噬細胞增殖活性，而大黃加丹參組有優于大黃加復方丹參組趨勢。形成這種趨勢的原因可能是中藥降香在其中調控的結果。

中藥白及具有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌之功效，是一種常用的中藥。大黃與白及配伍顯著抑制小鼠腹腔巨噬細胞增殖活性實驗結果表明，具有止血功效的藥味協同大黃增強抑制巨噬細胞增殖活性，同時驗證了具有止血功效的中藥降香下調巨噬細胞增殖活性的趨勢。但是中藥白及和降香兩種藥物，是否能協同大黃進一步調控巨噬細胞增殖活性，有待于深入研究。

[1] 鄧文龍.試論中藥復方配伍合理性研究與評價[J].中藥藥理與臨床,2008，24（1）：73-76.

[2] 曹蘭秀，頓寶生.試從中藥配伍的特殊性談中藥復方藥動學研究[J].陜西中醫,2008，29（1）：96-98.

[3] 劉昌孝.中藥藥代動力學研究的難點和熱點藥學學報[J].2005，40（5）：395-401.

[4] 張志芳，郭 靜，劉晉權.近十年來中藥藥對研究進展[J].內蒙古中醫藥,2007，26（1）：70-73.

[5] Fang Wang,Li-ting Cao，Song-hua Hu.A rapid and accurate 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide colorimetric assay for quantification of bacteriocins with nisin as an example[J].Zhejiang Univ Sci B,2007,8(8):549-554.