脊髓損傷大鼠脊髓VRI表達及意義

張 大 范應中 王家祥 張 謙

鄭州大學第一附屬醫院小兒外科 鄭州 450052

辣椒素(capsaicin)是一種自紅辣椒中提取的香草酰胺衍生物。辣椒素膀胱內灌注通過降低神經原性逼尿肌反射亢進改善尿失禁癥狀。Caterina等用表達克隆分析的方法在大鼠體內克隆出了第一個和辣椒素發生作用的vanilloid受體1,即VRI。高位脊髓損傷后常引起逼尿肌反射亢進,其脊髓中VRI表達有何變化尚不清楚。本試驗研究脊髓橫斷大鼠脊髓中VRI的表達改變,以期了解VRI表達與逼尿肌反射亢進關系。

1 材料與方法

1.1試劑VRI一抗,兔多克隆 IgG抗體,購自Santa Cruz公司。SP9001免疫組化試劑盒。

1.2實驗模型雌性 SD大鼠 50只,體質量 250～280 g。隨機分成5組:模型1周組、2周組、3周組、4周組各10只,假手術對照組10只。模型組大鼠腹腔內注射水合氯醛麻醉,胸段背部正中縱切口,咬除 T8、T9棘突,切除椎板,自T8、T9完全橫斷脊髓后縫合切口。假手術組僅暴露出脊髓后縫合切口。

1.3術后處理所有大鼠術后分籠飼養;術中及術后5 d內腹腔注射氨芐青霉素預防感染,1次/d;術后1周內對所有大鼠均按壓腹部輔助其排尿,早晚各1次;1周后,對模型組大鼠每天刺激尿道及肛門周圍皮膚引發大鼠排尿,假手術組大鼠自主排尿。模型組大鼠因感染及腹瀉等因素死亡7例,1周組死亡1例,2周組死亡2例,3周組死亡1例,4周組死亡3例。

1.4標本取材、染色模型組分別在術后1周、2周、3周、4周取標本。假手術對照組在術后2周取標本。取材時用4℃生理鹽水及4%多聚甲醛行主動脈灌注。解剖出脊髓,按照大鼠的脊髓解剖特點,分出各脊髓節段,分別取L4、L5、L6、S1脊髓節段,常規石蠟包埋、4 μ m 切片,免疫組化 SP法染色;每一批染色均設空白對照。

1.5免疫組化結果評價用Image J圖像分析系統對免疫組化結果進行分析,以平均灰度值作為測量指標。測量陽性表達的脊髓后角淺層(I層、Ⅱ層)的平均灰度值記作陽性灰度值,與其相鄰區域的脊髓灰質的平均灰度值記作背景灰度值,以兩者之差的絕對值作為相對灰度值,以相對灰度值作為統計量。

1.6統計學處理數據用均數±標準差(s)表示,應用SPSS 10.0分析軟件,對脊髓中VRI表達用兩因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1動物術后一般情況觀察假手術對照組大鼠手術后活動自如,可自主排尿,無術后腹部隆起及泌尿系感染情況;模型組大鼠術后即出現后肢癱瘓,術后5 d左右出現后腹部膨隆的腫物,為擴大的膀胱,1～2周開始出現反射性排尿,刺激尿道周圍皮膚可引發大鼠反射性排尿,同時出現后肢痙攣性癱瘓。

2.2 VRI表達結果假手術對照組和各模型組大鼠脊髓L4、L5、L6、S1各節段中均有 VRI的表達。VRI陽性表達呈棕黃色、深棕色,各節段陽性表達區域局限于脊髓后角淺層(I層、Ⅱ層)的神經纖維。空白對照片中無VRI陽性染色。各組各脊髓節段VRI相對灰度值見表 1。

表1 各組及各脊髓節段VRI表達的相對灰度值 (s)

表1 各組及各脊髓節段VRI表達的相對灰度值 (s)

組別 L4 L5 L6 S1假手術對照組 0.489±0.099 0.992±0.128 2.017±0.255 1.518±0.179模型1周組 0.957±0.139 4.391±0.385 23.416±2.550 13.246±1.643模型2周組 2.509±0.342 9.085±1.243 32.885±6.784 21.384±5.306模型3周組 3.328±0.451 10.132±1.870 36.661±5.741 23.847±4.099模型4周組 3.456±0.663 12.050±1.765 40.206±5.691 27.520±6.316

VRI在各脊髓節段表達不同(F=527.662,P=0.000),兩兩之間比較差異有統計學意義,表達強度依次為L6＞S1＞L5＞L4;各組之間表達差異亦具有統計學意義(F=227.373,P=0.000)。見圖1。

圖1

3 討論

辣椒素具有多種生物學效應,其生理特性之一是選擇性作用于感覺神經系統的外周部分,尤其是C型的初級傳入神經,可消除自感覺神經末梢釋放的P物質等神經遞質刺激所產生的疼痛沖動,被廣泛應用于疼痛機制和外周疼痛藥物治療等方面的研究[1]。辣椒素膀胱內灌注可增加平均膀胱容量,降低最大膀胱逼尿肌壓力,減輕患者逼尿肌反射亢進及尿失禁癥狀,其治療效果與辣椒素的濃度具有相關性[2]。

辣椒素與V RI結合后,VRI通道開放,大量的Ca2+和Na+流入神經細胞,而后較高的細胞內Ca2+離子水平引起電壓敏感性Ca2+傳導,阻斷重要的代謝通路,釋放聚集在外周神經末梢的神經肽,如P物質和鈣基因相關肽[3-4]。因此推測,脊髓損傷后神經原性膀胱的逼尿肌的高反射性與脊髓VRI表達改變有關。

術后假手術對照組和模型組大鼠 L4、L5、L6、S1四個節段脊髓后角中均有VRI陽性表達,L6節段VRI陽性表達最強,S1次之,L5中等表達,L4表達最弱,這說明大鼠膀胱傳入神經中C纖維主要傳入L6和S1脊髓節段,即大鼠脊髓排尿中樞的感覺傳入沖動主要傳至L6和S1脊髓節段,大鼠膀胱的脊髓感覺中樞位于L6和S1節段。與其他研究方法得出的結果相同。

除各脊髓節段VRI表達有差異外,假手術對照組和模型組相同一節段VRI表達也存在差異。說明脊髓橫斷是下位脊髓中VRI表達增強的原因,脊髓損傷后存在某種機制使VRI在膀胱初級傳入神經中的表達增加。

脊髓各節段在脊髓橫斷后V RI的表達增強,并于橫斷后2周左右基本達到較高水平,這個時間與所觀察到的脊髓橫斷后大鼠自發反射排尿出現的時間相一致;而以前的臨床研究也證實,辣椒素膀胱內灌注后患者反射亢進癥狀消失或減輕,由此可以推測脊髓橫斷后大鼠膀胱傳入神經中VRI表達的增加可能是逼尿肌反射亢進的原因之一。

VRI陽性表達局限于脊髓后角淺層(I層、Ⅱ層)的神經纖維,而后角的神經元未見有VRI陽性表達。這說明脊髓中VRI表達的神經纖維為感覺神經的傳入纖維,而感覺傳入神經的二級神經元(脊髓后角的神經元)無VRI的表達,也就是說VRI表達在初級傳入神經上。由此可知VRI參與了初級傳入神經元對外周感覺(膀胱傷害性刺激)沖動的傳入。但通過本研究不能確定脊髓后角淺層VRI的合成部位,據推測可能來自于同節段脊髓后根神經節細胞。Sanchez等[5]證實在脊髓后根神經節細胞中有VRI RNA分布。也就是說脊髓后角增加的VRI可能來源于同節段的脊髓后根神經節細胞。因此,脊髓橫斷后大鼠脊髓后角淺層VRI表達增強,可能是膀胱逼尿肌反射亢進的原因之一。

[1]M ark Hayman,Peter CA.Capsaicin:A review of its pharmacology and clinical applications[J].Current Anaesthesia&Critical Care,2008,19:338-343.

[2]Daniel N,Cortright,Arpad Szallasi.The role of the vanilloid and related receptors in nocicepto r function and neuroimmune regulation[J].Neuro Immune Biology,2009,8:101-117.

[3]Szallasi A,Fowler CJ.After a decade of intravesical vanilloid therapy:still more questions than answers[J].Lancet Neurol,2002,1:167-172.

[4]Sanchez JF,Krause JE,Cortright DN.The distribution and regulation of vanilloid receptor V RI and VRI 5'splice variant RNA expression in rat[J].Neuroscience,2001,107(3):373-381.