bFGF對大鼠局灶性缺血再灌注腦組織HSP-70蛋白表達的影響

聞公靈 婁季宇 白宏英

1)河南南陽市中心醫院神經內科 南陽 473009 2)鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014

缺血性腦血管病病理過程復雜。腦缺血再灌注損傷發生、發展的分子機制的研究,一直是近年來神經科學的研究熱點。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)能減少缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡的發生,為了解其作用機制,本實驗通過建立大鼠腦缺血再灌注模型探討bFGF對腦缺血再灌注損傷后熱休克蛋白70(heat shock protein-70,HSP-70)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表達的影響及其與神經細胞凋亡的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組選擇體質量為270～320 g的健康SD大鼠,雌雄各半(由河南省實驗動物中心提供),隨機分成假手術組,缺血再灌注組,bFGF組,每組 8只。

1.2動物模型制作用體積分數為10%的水合氯醛300 mg·kg-1麻醉,采用 Longa等[1]的線栓法建立大腦中動脈(MCA)閉塞模型。缺血再灌注組及bFGF組均給予缺血1 h再灌注24 h,屆時灌注取腦、固定、脫水、透明、包埋。假手術組除不插線外,余同上。

1.3給藥方法bFGF為北京雙鷺藥業股份有限公司研制,用注射用水稀釋,bFGF組腹腔注射10μ g·kg-1,其余組腹腔注射等量生理鹽水,缺血后即刻給藥。

1.4免疫組織化學染色檢測HSP-70和Caspase-3采用SABC法石蠟切片常規脫蠟至水,過氧化氫封閉,抗原熱修復20 min,血清封閉,滴加 1∶100兔抗 HSP-70抗體、兔抗Caspase-3抗體(購自中山生物試劑公司),4℃過夜,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate bufferad satine,PBS)洗,滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1h,PBS洗,滴加ABC復合物37℃孵育1 h,PBS液洗,DAB顯色,鏡下控制反應時間,雙蒸水終止反應,脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。10×40倍光鏡下,在缺血區計數5個視野,計數陽性細胞數,取其均值,以陽性細胞數/高倍視野表示。

1.5 T UNEL法原位檢測凋亡細胞T UNEL試劑盒購自武漢Boster生物工程公司。從每只大鼠的連續切片中隨機抽取,參考試劑盒說明書進行T UNEL法染色檢測凋亡細胞。簡述如下:石蠟切片脫蠟至水,0.2%蛋白酶K消化30 min,TdT反應液37℃濕盒孵育60 min,生物素化抗地高辛抗體于37℃反應30 min,SABC法染色,最后DAB顯色,蘇木素復染,封片后光鏡觀察。在光鏡400倍視野下在缺血區計數5個視野,計數陽性細胞數(鏡下核染色棕黃色),以均值作為陽性細胞數。

1.6統計學處理采用SPSS 12.0統計分析軟件進行處理,數據以均數±標準差(s)表示,組間比較采用 t檢驗。取α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1缺血再灌注后各組腦細胞組織學變化假手術組神經元形態正常,結構完整,未見壞死細胞,無間質水腫。缺血再灌注組在基底節,皮質下白質和皮質區可見明顯梗死灶,神經元胞體腫脹核碎裂、溶解,核固縮,胞漿染色變淡細胞間隙增寬,間質水腫明顯。bFGF組梗死灶也位于基底節及皮質下白質,部分累及皮質,多數神經元結構較完整,形態相對正常,間質水腫輕。

2.2細胞凋亡和Caspase-3蛋白檢測結果光鏡下,凋亡細胞核呈棕黃色,染色質聚集,靠邊形成環狀、斑塊狀或新月體狀,可見凋亡小體形成;HSP-70及Caspase-3陽性細胞胞漿呈棕黃色,三者主要分布于梗死灶邊緣區。假手術組偶見凋亡細胞HSP-70和Caspase-3陽性細胞,bFGF組凋亡細胞數和Caspase-3陽性細胞數明顯低于缺血再灌注組(P＜0.05和P＜0.05),bFGF組hsp-70陽性細胞數明顯較缺血再灌注組增加(P＜0.05)。見表1。

表1 2組凋亡細胞和Caspase-3陽性細胞數比較

3 討論

神經細胞死亡是腦梗死的病理基礎。近年來研究發現,腦缺血再灌注損傷可誘導神經元凋亡。大鼠缺血再灌注30 min即可出現細胞凋亡,24～48 h凋亡的細胞最多,可一直持續到28 d[2]。本實驗觀察到,缺血1 h再灌注24 h,缺血區可見成簇核被染成棕黃色的凋亡細胞。

Caspase-3是Ced-3相關半胱氨酸蛋白酶,被認為是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶,是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路[3]。有研究發現,缺血可使腦組織Caspase-3表達增加,Caspase-3過度表達可導致神經細胞凋亡[4],在缺血性神經損傷過程中,抑制Caspase-3活性可產生明顯的神經保護作用[5]。本實驗應用免疫組化法觀察缺血1 h再灌注24 h皮質區Caspase-3的表達,發現假手術組在相當于損傷區皮質,偶見Caspase-3陽性細胞,缺血再灌注組Caspase-3陽性細胞明顯增多且與凋亡細胞分布一致。雖然bFGF組Caspase-3陽性細胞仍較多,但較缺血再灌注組相比,明顯減少(P＜0.05),提示bFGF能通過抑制Caspase-3的表達而減少細胞凋亡的發生。

bFGF是一種重要的神經營養因子,廣泛分布于成熟和未成熟的中樞神經系統內,通過與其相應受體結合發揮神經保護作用。Li等[6]在大鼠MCAO后2 h,靜脈給予bFGF,缺血24 h區皮質梗死面積縮小32%,且神經功能缺損癥狀明顯改善。Sugimori等[7]研究bFGF對缺血腦組織的遠期影響,發現bFGF能使大鼠pMCAO 3個月后腦組織梗死體積降低27%。我們的實驗觀察到bFGF能使缺血區神經元凋亡數顯著減少(P＜0.05),改善缺血區腦組織病理學變化,減輕腦水腫。但其作用機制尚不十分明了。

HSP-70是一類應激保護性蛋白,正常腦組織HSP-70含量極少,當受到有害刺激時,受損細胞內的變性蛋白可誘導HSP-70表達[8]。腦缺血再灌注后HSP-70表達上調是神經元遭受可逆性損害的一種代償性修復機制,其表達水平被認為是細胞受損敏感的指標。本實驗結果表明:腦缺血再灌注后24 h,腦缺血再灌注區HSP-70陽性細胞明顯增多。bFGF組與缺血再灌注組之間在HSP-70陽性細胞表達上存在明顯的變化,bFGF提高了HSP-70的表達。實驗觀察到bFGF組病灶區多數神經元結構較完整,形態相對正常,間質水腫輕,提示HSP-70在腦缺血再灌注損傷后應激保護作用中起到重要作用,bFGF能有效上調HSP-70的表達,抑制細胞凋亡,減輕腦組織損傷,增強細胞對缺血再灌注的耐受性。HSP-70抗細胞凋亡作用的具體機制較復雜,尚需進一步研究,抑制Caspase-3的活化可能是其作用之一。

[1]Longa EZ,Weinsein P R,Canson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion with craniectony in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]M allei A,Aden SA,Bachis A,et al.The nitrosteroid NCX 1015,a prednisolone derivative,improves recovery of function in rats after spinal cord injury[J].Brain Res,2005,1062(1/2):16-25.

[3]Neumar RW.Molecular mechanisms of ischemic neuronal injury[J].Ann Emerg Med,2000,36(5):483-506.

[4]Loetscher H,Niederhauser O,Kemp J,et al.Is caspase-3 inhibition a valid therapeutic strategy in cerebral ischemia[J].Drug Discov Today,2001,6(13):671-680.

[5]Li Q,Stephenson D.Postischemic administration of basic fibroblast g rowth factor improves senso rimoter function and reduces infarct size following permanent focal cerebral ischemia in the rat[J].Exp Neurol,2002(2),177:531-537.

[6]Sugimori H,Speller H,Finklestein SP.Intravenous basic fibroblast growth factor produces a persistent reduction in infarct volume following permanent focal ischemia in rats[J].Neurosci Lett,2001,300(1):13-16.

[7]盧艷秋,婁季宇,白宏英,等.托吡酯對大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡和HSP-70表達的影響[J].中國實用神經疾病雜志,2007,10(3):86-88.