丁苯酞對血管性癡呆大鼠認知功能、海馬神經(jīng)元結構及nNOS的影響

孫玉華 盧 宏

1)河南大學淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 開封 475000 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

丁苯酞,其活性成分為dl-3-正丁基苯酞,其左旋體存在于芹菜籽中[1]。多年的動物實驗研究證明,丁苯酞對缺血性卒中具有較好的治療作用[2]。丁苯酞能否治療血管性癡呆給人們提出了新思路。根據(jù)文獻報道,大鼠雙側頸總動脈結扎后能造成大鼠明顯的學習記憶障礙[3],本實驗通過建立VD動物模型,應用水迷宮、透射電鏡及免疫組化方法對各組大鼠學習記憶、神經(jīng)元結構、nNOS表達進行觀察,探討丁苯酞對VD的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 動物:均選用 14～15月齡的健康SD大鼠100只,體質(zhì)量450～550 g,由河南省實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物及試劑:丁苯酞:批號:050106。nNOS多克隆抗體和SP試劑盒來自博士德公司。

1.2動物模型的建立及分組與給藥

1.2.1 動物模型的建立:根據(jù)Olsson方法[4]結扎雙側頸總動脈。假手術組分離但不結扎頸總動脈。

1.2.2 動物分組與給藥方法:將造模成功的VD大鼠隨機分為模型組(MDG)、丁苯酞高劑量組(DBT1)及丁苯酞低劑量組(DBT2),加上假手術組(SOG)及丁苯酞預防組(DBT3)共5組。DBT1及DBT2組造模后第61天開始治療,分別灌服丁苯酞12 mg/100 g/d、6 mg/100 g/d;MDG和SOG以等量消毒花生油灌胃;DBT3組術前30天灌服丁苯酞8 mg/100 g/d;各組均每日1次給藥,連續(xù)給藥30 d。

1.3癡呆標準以假手術組大鼠逃避潛伏期的平均值作為參考值,計算結扎大鼠逃避潛伏期的平均值與參考值之差占該鼠逃避潛伏期的比值,若該值大于20%為癡呆鼠。

1.4觀察指標

1.4.1 大鼠學習記憶能力的測定:參照 Morris水迷宮[5]行定位航行實驗及空間搜索實驗術后61 d按上述方法進行學習記憶測試,按癡呆標準判定VD模型。治療后第31天再進行水迷宮測試。

1.4.2 電鏡標本的制備:大鼠斷頭處死后,參照大鼠腦圖譜,迅速切取右側海馬區(qū)組織塊,迅速放入預冷4℃的4%的戊二醛中固定,常規(guī)脫水、Epon812環(huán)氧樹脂包埋,LKB超薄切片,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色,日立H-7500型透射電鏡觀察。

1.4.3 免疫組化染色:按常規(guī)操作進行。

1.5定量分析計數(shù)在海馬區(qū)選擇3個相鄰視野,在400倍光鏡下作免疫反應陽性神經(jīng)元計數(shù),結果取3個視野的平均值。

1.6統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(s)表示,然后運用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),多個樣本均數(shù)的兩兩比較用q檢驗法。α=0.05為檢驗水準。

2 實驗結果

2.1各組大鼠水迷宮實驗學習記憶成績比較表1。

2.2透射電鏡觀察假手術組可見神經(jīng)元細胞器結構正常;模型組可見神經(jīng)細胞高度水腫,細胞核變性,線粒體腫脹,嵴的雙層膜結構不清、斷裂、萎縮,正常線粒體少見;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴重脫顆粒。大劑量丁苯酞組鏡下觀察神經(jīng)元正常或輕度異常,可見次級溶酶體,線粒體,高爾基體神經(jīng)細胞線粒體嵴清晰,正常線粒體多見;小劑量丁苯酞組及預防組可減輕神經(jīng)細胞變性及線粒體等細胞器的異常變化。

表1 各組大鼠逃避潛伏期及跨平臺次數(shù)比較

2.3各組海馬nNOS陽性細胞表達的比較表2。

表2 各組海馬nNOS及SS陽性細胞表達的比較

3 討論

本實驗大鼠的逃避潛伏期及跨平臺次數(shù)變化提示模型組大鼠發(fā)生學習記憶障礙,電鏡提示模型組大鼠發(fā)生細胞變性水腫,不同劑量丁苯酞治療后大鼠學習記憶改善,細胞變性水腫減輕。這與以往研究[6]丁苯酞改善腦缺血狀態(tài)一致。

人們發(fā)現(xiàn)了海馬突觸傳遞的長時程增強(long term potential,LTP)現(xiàn)象,這種突觸傳遞的可塑性變化與學習記憶如此相似,使得人們自然把海馬作為研究學習記憶的首選靶位。研究表明,一氧化氮(nitric oxide,NO)很可能就是 LTP得以產(chǎn)生的關鍵信使[7],用多種離體或在體實驗手段干擾大鼠海馬區(qū)NO的水平,都會使LTP和學習記憶能力受到影響[8],由此反推,癡呆時海馬區(qū)NO的水平會有所變化。因為NO的生物半衰期極短,常用NOS的表達表示NO的活性[9]。腦內(nèi)NOS至少有三型[10]:神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘導型NOS(iNOS)和內(nèi)皮型 NOS(eNOS)。Huang等[11]確定了nNOS的神經(jīng)毒性作用。本實驗顯示,慢性缺血各組大鼠nNOS表達的陽性細胞數(shù)均有不同程度升高,這與王金蘭的研究不一致。丁苯酞治療可明顯對抗慢性腦缺血時nNOS活性的升高,減輕其神經(jīng)毒性作用。

至于丁苯酞的作用機制,可能十分復雜,丁苯酞抑制大鼠腦組織中nNOS的過度表達,減輕細胞變性水腫,可能是丁苯酞治療VD的神經(jīng)生化基礎之一。

[1]崔麗英,李舜偉,呂傳真,等.丁基苯酞軟膠囊治療中度急性缺血性卒中的多中心開放臨床研究[J].中國腦血管病雜志,2005,2(3):112-115.

[2]Fiorella D,Heiserman J,Prenger E,et al.A ssessment of the reproducibility of postprocessing dynamic CT perfusion data[J].AMJN,2004,25:97-107.

[3]姜曉蕊,盧宏,馮建玉,等.17 β雌二醇對血管性癡呆大鼠BDNF表達的影響[J].實用神經(jīng)疾病雜志,2005,8(2):3 941.

[4]Olsson Y,Brun A,Engiuund E.Fundamental pathological lesions in vascular dementia[J].Acta Neurol Suppl,1996,168:31-38.

[5]Morris R.Developments of a water maze procedure for studying spatial learning in the rat[J].Neurosic Methods,1984,11(1):4 760.

[6]沈瑞樂,王興萍,滕軍放,等.丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠海馬膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達的影響[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2008,43(2):306-308.

[7]Groves JT,Charles CY.Nitric oxide synthase:models and mechanisms[J].Current Opinion in Hemical Biology,2000,4:687-695.

[8]Prast H,Philippu A.Nitric oxide as modulator of neuronal function[J].P rogress in Neurobio,2001,64:51-68.

[9]鐘慈聲,孫安陽.一氧化氮的生物醫(yī)學[M].上海:上海醫(yī)科大學出版社,1997:36-85.

[10]Gajkowska B,Gniadecki R.Induction of endothelial nitric oxide synthase in perivascular mast cells in rat neurohypophysis after ischemia[J].Neuroendocrinol Lett,2003,20(3/4):189-193.

[11]Huang Z,Huang PL,Panahian N,et al.Effects of cerebral ischemia in mice deficient in neuronal nitric oxide synthase[J].Science,1994,265:1 883-1 885.