莪術油葡萄糖注射液的 HPLC指紋圖譜研究

李 睿,方洪壯,孫長海,張 宇,劉利成,李百強

(1.黑龍江成功藥業有限公司,黑龍江 哈爾濱 150025;佳木斯大學藥學院,黑龍江 佳木斯 154007;2.哈藥集團生物工程有限公司,黑龍江哈爾濱 150020;3.黑龍江省藥品不良反應監測中心,黑龍江哈爾濱 150076)

莪術油葡萄糖注射液是一種中藥抗病毒制劑,收載于2005版的中國藥典二部,用于治療小兒病毒性肺肺炎[1]。HPLC方法控制莪術油葡萄糖注射液的質量,僅見部分有效成分的測定[2～4],缺少色譜指紋圖譜的研究。基于 HPLC方法可免除由于大量的表面活性劑的存在而引起的相當困難的前處理過程[5],高沸點倍半萜類含氧衍生物,能得到較短的分離時間以及較高的柱效,采用 HPLC建立莪術油葡萄糖注射液的指紋圖譜研究,結果表明,方法簡便、可靠、重復性好,可作為莪術油葡萄糖注射液質量控制的標準。

1 實驗材料

1.1 樣品來源

提取莪術油用的藥材均購于溫莪術 GAP種植基地瑞安市陶山鎮沙洲村,經佳木斯大學藥學院生藥教研室宗希明老師鑒定為溫莪術。注射液10批,按照莪術油葡萄糖注射液制劑工藝要求制成。

1.2 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀(美國 Agilent公司),吉馬酮對照品 (中國藥品生物制品檢定所,批號為10753-200212);莪術二酮對照品(上海滬云醫藥開發有限公司,質量分數為98%);莪術醇對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號為0080-20050521);乙腈、甲醇為色譜純,磷酸為分析純。依地酸二鈉、吐溫-80(注射用)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Zorbax Eclipse XDB-C18分析柱 (250mm× 4.6mm ID,5μm),Eclipse XDB C18保護柱 (12.5mm× 4.6mm ID,5 μm),自動進樣器;檢測波長210nm,柱溫為30℃,流動相為乙腈(A)和1‰磷酸水溶液 (B)。A相濃度洗脫梯度：0min,55%;5min,55%;30min,75%;45min,90%;55min,90%,流速1mL/min。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取莪術二酮、莪術醇、牛兒酮對照品適量,另精密吸取 β-欖香烯對照品適量 ,用甲醇制成4種對照品濃度分別為 0.2mg/mL、0.025mg/mL、0.1mg/mL、0.2μL/mL的混合溶液,作為對照品混合溶液。

2.3 空白溶液的制備

取 0.18g的吐溫80,再加入0.25mg依地酸二鈉,用葡萄糖溶液定容至50mL容量瓶中,作為空白溶液。

圖1 注射劑、對照品及空白溶液的指紋圖譜

2.4 測定方法

分別吸取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液各20 μL,用0.45 μm的微孔濾膜濾過,取續濾液進樣。結果見圖1。空白溶液對莪術油葡萄糖注射液的指紋圖譜的檢出無干擾。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度

同一供試液,連續進樣 5次。所得到指紋圖譜的與其中位值的相關系數分別為 0.9972、0.9995、0.9981,0.9997和0.9955,相關系數均大于0.9970,各圖譜能夠很好的重合 ,表明儀器的精密度較好。

2.5.2 穩定性

同一供試液 ,分別在0、4、8、12,18及 24h進樣。不同時間測得的圖譜與其均值相關系數分別為 0.9989、0.9958、0.9981、0.9995,0.9940和 0.9904,均大于 0.9940,樣品在 24h內較穩定。

2.6 共有模式建立

取莪術油葡萄糖注射液7批,按上述色譜條件檢測,確定了9個特征峰構成莪術油葡萄糖注射液的指紋圖譜,共有模式圖見圖2。圖中,2號峰為莪術二酮,4號為莪術醇,6號為吉馬酮,8號為β-欖香烯。對所得到 HPLC指紋圖譜進行共有圖譜擬合,中位數法共有模式的相關系數為0.9701,0.9456,0.9711,0.9388,0.9804,0.9959,0.99632。均值法共有模式的相關系數為0.9774,0.9593,0.9790,0.9515,0.9722,0.9881,0.9940。采用相似度對其余3批注射液進行相似度評價,中位數法相關系數為0.9464,0.9240,0.9661;均值法相關系數為0.9569,0.9212,0.9607。

圖2 注射液共有模式圖

3 討論

3.1 共有峰的確定

選用吉馬酮為參照物,選用超過其峰面積5%,保留時間和峰面積比較穩定的色譜峰為共有峰。

3.2 流動相 pH與檢測波長

基于注射液中的主要成分,具有一定的酸性,為加強色譜分離效果,流動相中添加磷酸。兼顧色譜中多種倍半萜類含氧衍生物成分的吸收特征,選擇210 nm為檢測波長。

[1]國家藥典委員會.中國藥典 2005年版二部 [S].北京：化學工業出版社,2005,592

[2]謝永忠,夏泉.高效液相色譜法測定莪術中吉馬酮的含量 [J].中國藥房,2005,16(6)：461

[3]黃趙剛,李紹平,李俊,等.反相 HPLC法測定莪術油葡萄糖注射液中莪術醇和吉馬酮的含量 [J].中成藥,2005,27(10)：1141

[4]李成網,王唯紅.高效液相色譜法測定莪術油中莪術二酮和牦牛兒酮的含量 [J].中國實驗方劑學雜志,2007,13(3)：12

[5]吳雨川,劉天揚,姜連閣,等.RP— HPLC法測定莪術油中莪術醇和吉馬酮含量[J].中醫藥信息,2004,21(4)：64