川芎嗪注射液抑制子宮內(nèi)膜異位癥微血管密度的實(shí)驗(yàn)研究

孫盛梅,吳雅冬,周德娟

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,黑龍江 佳木斯 154003)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是育齡期婦女的常見(jiàn)病和多發(fā)病,近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì),這種性質(zhì)良性而行為卻類似惡性的疾病長(zhǎng)期困擾著臨床治療。傳統(tǒng)的藥物和手術(shù)治療等方法存在較大副反應(yīng)及較高復(fù)發(fā)率[1]。因此,尋求新的治療措施如“源頭治療”成為近幾年研究熱點(diǎn)。本文通過(guò)建立 Wistar大鼠子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型,觀察川芎嗪對(duì)大鼠異位內(nèi)膜血管生成的抑制作用,為抗血管生成治療子宮內(nèi)膜異位癥提供新的藥物及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料方法

1.1 主要試劑

鹽酸川芎嗪注射液(TM P,無(wú)錫市第七制藥廠,40mg/2mL,批號(hào)9803161)。鼠抗人 CD34免疫組化單克隆抗體、S-P超敏試劑盒(鼠 /兔)均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型的構(gòu)建

50只雌 性 Wistar大鼠(60～ 70d)體重 190～ 240g購(gòu)自佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。術(shù)前采用人工動(dòng)情,大鼠用氯胺酮麻醉后,消毒腹部 ,剃除手術(shù)區(qū)的被毛 ,碘酊消毒手術(shù)區(qū);于腹中線尿道上1cm處行縱向切口,長(zhǎng)約2cm,挑出右側(cè)子宮角,切取長(zhǎng)1cm子宮組織,剪成5mm×5mm的內(nèi)膜組織片段。將其內(nèi)膜面向子宮體與直腸之間的后壁進(jìn)行四角縫合,關(guān)閉腹腔。每日腹腔注射4萬(wàn) u/mL慶大霉素0.1mL,連續(xù)使用3d。4周后第 2次開腹觀察結(jié)果,成模的大鼠經(jīng)大體觀察和組織學(xué)證實(shí)并測(cè)量移植物體積。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將成模的大鼠40只隨機(jī)分為四組。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別給予：TM P50 mg˙kg-1˙d-1、TM P 100mg˙kg-1˙d-1、TM P 200mg˙ kg-1˙d-1連續(xù)15d,ip。對(duì)照組：給予等量的生理鹽水。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法

連續(xù)給藥 15d后 24h第 3次剖腹檢查種植物的生長(zhǎng)情況。無(wú)菌條件下采集大鼠異位內(nèi)膜組織,4%多聚甲醛液固定。將上述標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理,切成 5μm厚的石蠟切片,進(jìn)行免疫組化的檢測(cè)。用鼠抗人 CD34免疫組化單克隆抗體進(jìn)行微血管密度(MV D)檢測(cè);采用兩步法。

血管計(jì)數(shù)：免疫組織化學(xué)染色后先在低倍下選擇內(nèi)皮細(xì)胞染色最多的區(qū)域,再在高倍鏡下下尋找將胞質(zhì)呈黃染的與周圍其他組織有明顯界限的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞串,無(wú)論有無(wú)管腔,計(jì)數(shù)為1個(gè)血管。計(jì)數(shù)這一區(qū)域的血管個(gè)數(shù),記錄每高倍視野的血管數(shù),選血管數(shù)最多的5個(gè)數(shù)值的平均數(shù)作為MVD。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以s表示,各組間差異采用配對(duì) t檢驗(yàn),直線相關(guān)分析,以 P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 治療前后各組移植物體積的比較

將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為 4個(gè)組,兩腳規(guī)測(cè)量種植物的體積。

表1 治療前后移植物體積(mm3)的比較 (±s,n=10)

表1 治療前后移植物體積(mm3)的比較 (±s,n=10)

△與治療前相比 P＜0.01,▲與對(duì)照組比較 P＜0.05。

組別 治療前體積 治療后體積對(duì)照組 123.10±4.77 129.74±6.59低劑量組 125.96±5.78 117.49±4.82△▲中劑量組 126.26±3.36 101.01±3.15△▲高劑量組 125.70±5.17 77.09±6.82△▲

由表1中可以看出低劑量組的體積由治療前的125.96mm3下降至117.49mm3,平均下降了6.7%(P ＜0.05),中劑量組由 126.26mm3下降至 101.01mm3,平均下降了19.9%(P ＜0.01),高劑量組由125.70mm3降至77.09mm3,平均降了38.6% (P＜0.01),而對(duì)照組的體積較治療前有所上升達(dá)到 129mm3。

2.2 各組在位和異位內(nèi)膜 MVD值比較

見(jiàn)表 2。

表2 各組在位和異位內(nèi)膜 MVD值比較 (±s,n=10)

表2 各組在位和異位內(nèi)膜 MVD值比較 (±s,n=10)

★與對(duì)照組比較 P＜0.05,▲與低劑量組比較 P＜0.05。

組別 在位內(nèi)膜 異位內(nèi)膜對(duì)照組 19.73±0.26 23.51±0.54低劑量組 18.23±0.51 11.44±0.57★中劑量組 16.41±0.26 10.05±0.56★▲高劑量組 16.26±0.23 8.34±0.44★▲

由表2可以看出治療后低劑量組、中劑量組、高劑量組與對(duì)照組相比,MVD值表達(dá)有顯著差異 (P＜0.01),各組隨著劑量的增加 MV D值也明顯減少。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥常用的動(dòng)物模型有獼猴、狒狒、兔和大鼠等。獼猴、狒狒等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有自發(fā)的子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率,與人類最為相似,是最好的模型動(dòng)物,但是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物由于價(jià)格昂貴,飼養(yǎng)要求高,且疾病自發(fā)率低,極大的限制了其在研究中的廣泛應(yīng)用[2]。本實(shí)驗(yàn)選擇 Wistar大鼠,是因其激素水平較高,性周期短且規(guī)律,對(duì)移植物的成活和移植后的觀察均較為有利,且較經(jīng)濟(jì),手術(shù)移植法的成功率較高。本實(shí)驗(yàn)的建模成功率為80%與多數(shù)學(xué)者報(bào)道的結(jié)論一致[3]。目前 EMs的治療仍然是個(gè)十分棘手的問(wèn)題,治療手段主要是手術(shù)、藥物、或者手術(shù)合并藥物治療,現(xiàn)行的藥物治療主要是內(nèi)分泌激素藥物治療,只能抑制癥狀,不能清除異位病灶[4]。隨著對(duì)病因?qū)W的深入研究和分子生物學(xué)等相關(guān)科學(xué)的快速發(fā)展,抗黏附、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)劑和激素受體調(diào)節(jié)劑等“源頭治療”,己成為研究熱點(diǎn),為治療提供全新的對(duì)策。近年在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中探索一種以抑制異位病灶新生血管為靶點(diǎn)的治療 EMs的新方法。蔣紅清[5]等用抗血管生成劑作用在雞胚尿囊膜子宮內(nèi)膜異位病灶和小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶,證實(shí)抗血管生成治療 EMs的策略具有可行性,將成為治療的有效手段之一。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明川芎嗪具有廣泛的體內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)[6],而其中的一個(gè)重要機(jī)制就是抑制腫瘤的新生血管形成。文獻(xiàn)報(bào)道[7]川芎嗪濃度在 160 μg/mL抑制體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng),我們的研究結(jié)果再次證明,川芎嗪能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,同時(shí)發(fā)現(xiàn)川芎嗪亦能抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。這可能是川芎嗪抑制血管生成的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果表明,川芎嗪可以抑制 MV D在腫瘤組織中的表達(dá);以上結(jié)果均提示川芎嗪有抗腫瘤新生血管形成作用。由于腫瘤組織中新生血管形成的機(jī)制與 EMs新生血管形成的機(jī)制有相似之處,均是通過(guò)局部VEGF等血管形成促進(jìn)因子的超常表達(dá)誘發(fā)新生血管的形成,因此本實(shí)驗(yàn)采用川芎嗪治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥,并通過(guò)種植物體積及 MVD值的改變,進(jìn)一步證實(shí)川芎嗪對(duì)異位病灶的血管生成抑制作用的,有望成為 EMs抗血管生成治療新藥。

[1]趙玉,黃向華.子宮內(nèi)膜異位癥治療進(jìn)展 [J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(5)：503

[2]D’Hooghe TM.Clinical relevance of the baboon as a model for the study of endometriosis[J].Fertil Steril,1997,68(4)：613-625

[3]張薇,沈紅沁,黃啟玲,等.非動(dòng)情期 SD大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2004,12(1)：21-24

[4]郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥的研究與設(shè)想 [J].中華婦產(chǎn)科雜志,2003,38(8)：478-480

[5]蔣紅清,李亞里,鄒杰,等.抗血管生成治療子宮內(nèi)膜異位癥的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2007,23(5)：369-372

[6]陳剛,徐曉玉,嚴(yán)鵬科,等.川芎嗪和丹參對(duì)小鼠 Lewis肺癌生長(zhǎng)的抑制與抑制血管生成的關(guān)系 [J].中草藥,2004,35(3)：296

[7]楊麗蓉,徐曉玉.川芎嗪對(duì) V EGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 [J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2005,11(4)：278-279