慢性乙型肝炎病毒感染者H B V基因分型研究

呂洛堂 黃華健 張 丹

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬嗜肝DNA病毒科，基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環狀DNA。長鏈為負鏈，位置和長度相對固定。短鏈為正鏈，其長度可變，約為負鏈的50%～80%。HBV主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌，其基因序列高度變異。1988年Okamoto等[1]根據不同基因型之間的差異＞8%，將HBV DNA分為A～D4型，初步建立了乙型肝炎病毒基因分型標準。Naito等[2]基于HBV preS1至S基因建立了型特異性引物PCR分型法，該方法可以精確地確定A～F六個HBV基因型，不僅特異性高，而且快捷、方便。既往流行病學調查表明HBV基因型呈一定的地理區域分布[3-5]。湖南邵陽地區HBV基因型分布如何，有待于研究。

1 材料與方法

1.1 標本來源 168例慢性HBV感染者為湖南省邵陽市中心醫院和新寧縣回龍鎮中心衛生院門診和住院患者，其中慢性無癥狀HBV攜帶者(chronic asymptomatic HBV carrier，AsC)79例、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)68例、肝硬化(liver Cirrhosis，LC)21例。男105例，女63例，年齡13～76歲，診斷標準符合2000年第十次全國傳染病與寄生蟲病學會和肝病學分會聯合修訂的病毒性肝炎防治方案。所有患者均排除了丙型肝炎病毒感染及其他能導致肝臟病變的疾病。所有血清標本經檢測HBV血清學標志物后，貯存于-70℃待檢。

1.2 主要試劑 血清DNA抽提試劑盒，購自上海科華生物科技有限公司；PCR擴增試劑(2×pfu MasterMix)、D2000 Marker購自北京天根生物科技有限公司。

1.3 血清DNA提取 按試劑盒說明書進行，采用濃縮裂解法，稍做改動。操作步驟簡述如下：取50μL濃縮液加到0.5mL離心管中，再加入待測血清50μL，振蕩混勻后靜置2min，8000轉/min離心5min，棄上清。加入10μL裂解液，劇烈振蕩至無沉淀后短暫離心，沸水浴10min，14000轉/min離心15min，取上清液2μL為模板做PCR反應。

1.4 HBV基因型的檢測 采用型特異性引物分型法。按照文獻[6]介紹的方法進行。引物序列見表1，由上海生工生物科技有限公司合成。首先用外引物P1與P2進行第一輪PCR，反應體系為：引物P1(10μm)和P2(10μm)各0.5μL，2×Pfu MasterMix 12.5μL，模板1μL，ddH2O 10.5μL，總體積25μL。將上述組分混勻后，加40μL石蠟油覆蓋液面。擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環后72℃再延伸5min。同時以ddH2O作為陰性對照。然后以第一輪PCR產物為模板，分別以A組引物(B2、BA1R、BB1R、BC1R)和B組引物(B2R、BD1、BE1、BF1)為內引物進行第二輪PCR，檢測HBV基因型A、B、C和D、E、F。PCR反應體系中除引物外，其余成分同第一輪，同時以ddH2O作為陰性對照。擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環后72℃再延伸10min。最后將兩組第二輪PCR產物分別在30g/L瓊脂糖中進行電泳，同時加入分子量Marker(D2000)，在紫外光下通過PCR擴增產物片段的大小來判斷基因型。

1.5 統計學分析 兩個樣本構成比的比較采用x2檢驗，P 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

對邵陽地區168例不同臨床類型的慢性HBV感染者進行基因分型，可檢出B型、C型、混合型B+C和混合型B+D，分別占51.2%、42.2%、5.4%和1.2%，未發現A型、E型和F型。各臨床類型HBV基因型構成比見表2。慢性無癥狀HBV攜帶者與慢性乙型肝炎相比，HBV基因型構成比無顯著性差異(x2＝0.12，P＞0.05)。肝硬化患者HBV基因型與慢性無癥狀HBV攜帶者或慢性乙型肝炎相比，C基因型所占比例較高，經統計學處理，兩組之間基因型構成比無顯著性差異(x2＝4.63或3.61，P＞0.05)。

表1 巢式PCR HBV基因分型所用引物序列

表2 168例慢性HBV感染者血清HBV基因型分布[例(%)]

3 討論

我國屬HBV感染高流行區，流行病學調查表明HBV基因型呈一定的地理區域分布。在我國，HBV基因型主要是B型和C型， 但二者的分布也存在一定的地域差異[7-11]，南方以B型為主，北方以C型為主；A型和D型在多數地區也占有一定比例，目前尚未發現E型和F型。目前認為，不同地區優勢基因型反映了HBV自然感染史發生的變異特點，是病毒變異后進化的結果。肖揚等[7]對浙江溫州地區966例患者進行HBV基因分型發現，66.46%為C型，20.49%為B型，11.08%為混合型B+C。高俊薇等[12]對北京、長春、漢川、深圳、清遠和南京等11個城市的1214例HBV DNA陽性的慢性HBV感染者進行研究發現，0.7%為A型，58.4%為C型，28.4%為B型，12.4%為混合型B+C，未發現有D、E、F型。北方地區(長春、北京、石家莊)慢性HBV感染者中C基因型比較高，分別為58.2%、67.5%和63.6%，山東省聊城和濟南市的C基因型高達90.2%和87.9%。隨著地理位置南移，B基因型的比例逐漸增高，廣東省清遠和深圳市的B基因型比例分別為7.14%和63.6%。本研究慢性HBV感染者血清中，B型占51.2%，C型占42.2%，混合型B+C占5.4%，混合型B+D占1.2%，未發現A型、E型和F型。表明湖南邵陽HBV基因型仍以B型和C型為主。

目前研究發現，HBV基因型與臨床表現、預后、治療應答均有一定關系，不同基因型具有不同的致病性。Kao等[13]的研究結果提示，隨著疾病嚴重程度的增加，C型所占的比例升高，而B型所占比例降低，C型與較為嚴重的肝臟疾病有關。本研究表明，肝硬化患者主要以C型感染為主、其次為B型。C基因型在肝硬化患者中所占的比例較高，但與慢性無癥狀HBV攜帶者或慢性乙型肝炎相比，差異無統計學意義。

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[13]Kao JH,Chen PJ,Lai MY,et al. Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B[J].Gastroenterology,2000,118(3)：554-559.