P糖蛋白在骨肉瘤中的表達及其臨床意義

張世權 肖德明 關弘 李偉 譚紀鋒 朱玉華

大劑量新輔助化療的開展使骨肉瘤的治療取得了突破性進展。近10余年來，骨肉瘤的治療似乎進入了一個平臺期，其生存率難以進一步提高，原因之一可能與多藥耐藥基因(MDR)有關。我們應用免疫組織化學染色方法，檢測MDR產物P糖蛋白(p-gp)在36例骨肉瘤組織的表達，旨在探討骨肉瘤p-gp表達與骨肉瘤臨床預后的的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 36例骨肉瘤標本均為我院活檢或手術切除后經石蠟包埋存檔的組織并經病理學確診，其中男19例，女17例，年齡平均19.9歲。Enneking分期ⅡA3例，ⅡB27例，ⅢB6例，并發病理性骨折7例。所有病例手術時均未發現遠處轉移灶，取材前均未接受過放療和細胞毒性藥物治療。17例骨軟骨瘤均為少數切除后經石蠟包埋存檔的組織并經病理學確診。隨訪結果：36例骨肉瘤隨訪時間平均3.5a，其中存活3a及以上者13例，存活3a以下者23例，死亡病例均因骨肉瘤遠處轉移全身衰竭致死。

1.2 p-gp檢測方法 選擇含腫瘤細胞豐富切片之對應的石蠟包埋標本，常規經5μm厚連續切片，行鏈菌素親生物素-過氧化物酶法(S-P法)免疫組化染色，所有試劑均購自福州邁新公司,技術操作按規定程序進行。以PBS液代替一抗作為空白對照。

1.3 結果判定與統計學處理 油鏡(×100)下觀察p-gp染色分布于細胞膜和漿中，呈棕褐色顆粒狀，并為片狀或灶狀分布。每張切片觀察10個高倍鏡視野，取其平均數，陽性細胞數小于5%為陰性，大于5%為陽性。每份標本同時作 HE染色，行常規病理學檢查。統計學處理：不同組間p-gp表達結果統計學處理采用x2檢驗。

2 結果

36例骨肉瘤隨訪時間平均3.5a，其中存活3a及以上者13例，存活3a以下者23例，死亡病例均因骨肉瘤遠處轉移全身衰竭致死。36例骨肉瘤p-gp陽性表達率為50.0%，顯著高于骨軟骨瘤組，有顯著性差異(P＜0.01)。p-gp表達在不同Enneking外科分期組間無顯著性差異(P＞0.05)，在生存時間3a及以上組及3a以下組間有顯著性差異(P＜0.01)。見表1～3。

3 討論

P糖蛋白(p-gp)是多藥耐藥基因(MDR)編碼的蛋白質，它在多種人類惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、大腸癌及肝癌中均有較高表達。目前有關骨肉瘤細胞MDR基因p-gp表達的研究尚不多，但已有證據表明骨肉瘤常表現出p-gp高表達[1]。Stein等[2]用PCR技術證實9例骨肉瘤中的7例有MDR基因的異常。Wunder等[3]的研究發現15例骨肉瘤患者的18個標本均有不同程度的MDR表達。Kandel[4]應用免疫組化技術的研究表明10例骨肉瘤中有50%為p-gp表達陽性。本組應用免疫組化的方法，對MDR基因所編碼的p-gp在骨肉瘤組織中的表達進行了測定，結果發現在36例中，18例為陽性表達，陽性表達率為50.0%，顯著高于作為對照的骨軟骨瘤組，有顯著性差異(P＜0.01)，提示p-gp表達可能與骨肉瘤作為高度惡性腫瘤的生物學行為有關。關于P糖蛋白表達對骨肉瘤預后影響的研究，目前結論尚不一致。Wunder[3]在對一組骨肉瘤患者30個月的隨訪結果中發現MDR高水平表達的患者預后較差。Peabody等[5]在評價影響骨肉瘤患者預后因素時提出多藥耐藥基因及其產物p-gp的表達是一重要因素。郭偉[6]在對67例惡性骨腫瘤的(其中骨肉瘤20例)p-gp表達的免疫組化研究中發現：盡管p-gp陽性組的2a及5a生存率較陰性組低，但無顯著性差異。沈靖南[7]采用免疫組化LSAB法，檢測84例骨肉瘤中p-gp表達，半定量化計量p-gp的著色強度及陽性率，發現骨肉瘤p-gp表達的陽性率為55.1%，p-gp陽性表達中的65.2%為低表達，認為骨肉瘤組織分主流細胞群和稀有細胞群，它們表達p-gp有不同的預后價值：主流細胞群表達p-gp，體現于p-gp的表達量和范圍，早期發生肺轉移，預后不良；稀有細胞群表達p-gp的臨床意義取決于著色強度。高水平表達，肺轉移早，預后不良，而低水平表達，肺轉移遲，預后好于前者。Serra等[8]用半定量免疫熒光法檢測105例骨肉瘤，其中38例經隨訪2a發現：p-gp過度表達與高轉移率、預后不良有關。本研究結果顯示p-gp蛋白表達在不同Enneking外科分期組間無顯著性差異(P＞0.05)，在生存時間3a及以上組及3a以下組間有顯著性差異(P＜0.01)，生存3a以下的患者其p-gp表達陽性率明顯高于3a及以上的患者，表明p-gp表達對骨肉瘤患者的預后評估具有一定價值，p-gp陽性表達的骨肉瘤患者預后較差。當然，影響骨肉瘤預后的因素十分復雜，已有的證據證明與病理分型、外科分期、腫瘤大小、起病緩急、有無病理性骨折、堿性磷酸酶水平以及是否進行規范大劑量化療等多種因素有關。有關P53蛋白表達在骨肉瘤預后評估中的作用，有必要進一步進行大樣本研究和統計學分析。

表1 骨肉瘤與骨軟骨瘤的p-gp表達(例)

表2 骨肉瘤不同Enneking分期的p-gp表達(例)

表3 骨肉瘤不同預后的p-gp表達(例)

[1]應明.骨肉瘤多藥耐藥性及其逆轉[J].中華骨科雜志,1997,17(7)：461-463.

[2]Stein U,Walther W,Wanderlich V.Point mutations in the mdrl promoter of human osteosarcomas are associated with in vitro resposiveness to multidrug resistance relevant drugs[J].Eur J Cancer(Am),1994,30：1541-1548.

[3]Wunder JS,Bell RS,Wold L,et al.Expression of the multidrug resistance gene in osteosarcoma：a piolt study[J].J Orthop Res,1992,11：396-402.

[4]Kandel RA,Campbell S,Noble TS,et al.Correlation of P-glycoprotein detection by immunohistochemistry with mdrl mRNA level in osteosarcoma：piolt study[J].Diagn Mol Pathol,1995,4：59-65.

[5]Peabody TD,GibbS CP,Simon MA.Evalution and staging of musculoskeletal neoplasms[J].J Bone Joint Surg,1998,80(A)：1204-1218.

[6]郭偉,肖穎,盛傳家,等.P170和PCNA在惡性骨腫瘤中的表達[J].中華骨科雜志,1998,18：423-425.

[7]沈靖南,王晉,韓士英,等.骨肉瘤p-糖蛋白表達水平與肺轉移[J].中華骨科雜志,2000,20：21-24.

[8]Serra M,Scotlandi K,Manara MC,et al.Analysis of P-glycoprotein expression in osteosarcoma[J].Eur J Cancer (Am),1995,31：1998-2002.