改良硝酸脫鈣方法的研究及應用

劉憲軍 陳萍 徐林娜

在常規的病理技術工作中，經常會遇到骨、牙齒及其他鈣化組織需要做石蠟切片及蘇木素-伊紅（HE）染色，做一張好切片，難度很大。優良的脫鈣是做好石蠟切片及病理正確診斷的保證。硝酸是病理科最常用的脫鈣劑之一，它是借助使組織軟化并達到一定硬度后再做石蠟切片的一種方法。脫鈣的質量受多種因素影響，硝酸的濃度、溫度是脫鈣效果的關鍵。我們根據微波(microwave,MW)輻射效應的原理[1-3]，選用了“低溫微波-硝酸快速脫鈣”方法對骨、牙齒及其他鈣化組織進行脫鈣，在HE染色實際應用中獲得了良好效果[4-6]。

1 材料與方法

1.1 材料 吉林市中心醫院病理科2006～2009年50例骨組織。JDIII型醫用微波爐。硝酸試劑為北京化工廠生產。

1.2 方法 將骨組織鋸成大小為1.5cm×1.5cm×0.15cm，用10%甲醛固定24h，流水沖洗15min～lh。實驗組采用“低溫微波-硝酸快速脫鈣”方法脫鈣，首先將硝酸在冰箱中預冷保持10℃，硝酸脫鈣液的濃度10%。(1)在1000ml的大燒杯內放500ml冰水。(2)在500ml的小燒杯內放250ml經冰箱預冷的10%硝酸脫鈣液，然后放待脫鈣的組織。(3)將小燒杯放入大燒杯內，然后一同放入微波爐中。(4)250W脫鈣,并測量大、小燒杯中液體的溫度。當接近10℃時，向大燒杯中添加冰塊，或向小燒杯中添加預冷的脫鈣液，這樣脫鈣液溫度不會迅速升高,又發揮了微波效應，保證了脫鈣液的溫度始終控制在15℃以內，脫鈣時間骨密質需要50～55min,骨松質需要30～35min[7]。對照組采用室溫(20℃)硝酸,硝酸脫鈣液的濃度10%，脫鈣時間骨密質需要24～36h,骨松質需要12～24h，脫鈣后自來水沖洗4～6h[7]。實驗組和對照組脫鈣后，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，連續切片數張，厚4μm，65℃烤片3h。將切片進行HE染色，對比觀察。

2 結果

圖1 HE×100

圖2 HE×100

實驗組中的骨組織及鈣化組織經低溫微波-硝酸快速脫鈣方法過程處理后，一般可切出一張完整甚至連續、令人滿意的切片，HE染色后，顯微鏡下細胞核與細胞質結構清晰，紅藍相間，色彩鮮艷（圖1），從切片質量和染色等方面都明顯優于對照組。對照組中的骨組織及鈣化的組織經室溫(20℃)硝酸脫鈣液處理后，切片時刀片易產生缺口，制片不成型，厚薄不均，即使勉強切出片，質量也很差，染色時易脫片，顯微鏡下細胞核不著藍色，而是與細胞質等均為紅色，呈一片紅染(圖2)。所有這些都給病理醫生的診斷帶來困難。

3 討論

對骨及含鈣組織進行組織學觀察研究時，組織切片的制作是關鍵。但由于骨及含鈣組織硬，如果脫鈣不徹底可導致切片破碎甚至無法切片，因此組織制片前選擇合適的脫鈣液就顯得尤為重要。通常使用10%的硝酸水溶液對骨組織脫鈣，使骨組織中鈣鹽溶解于其中，然后用流水沖洗標本，需要的時間長，脫鈣不徹底，致使骨組織硬，難于得到完整的切片，即使勉強切出片，質量也很差，染色時易脫片。如果經過長時間脫鈣液處理后的組織，酸性太強，HE染色，顯微鏡下觀察細胞核不易著藍色，與細胞質均為紅色，呈一片紅染，分不清細胞核的結構，所有這些切片都會給病理醫生的診斷帶來困難。根據實際工作經驗，認為不能切出完整的切片，是因為脫鈣不徹底，組織過硬。HE染色不佳，是脫鈣液作用時間長，標本呈酸性，這些直接影響著染色效果，使細胞核、細胞質等均染為紅色。針對這些問題，為了得到一張高質量的含鈣組織的HE切片，經過多種硝酸脫鈣方法的實驗及處理，不斷摸索總結，從2006年至今，一共有50多例骨組織，使用低溫微波-硝酸快速脫鈣方法脫鈣，此種方法脫鈣液對骨組織的滲透力強，作用時間短，對組織的結構損壞小，可以迅速和方便地軟化硬韌的骨組織、牙齒及其他鈣化組織，易于切取較好的組織切片，又能更好保存細胞結構，解決標本因浸泡脫鈣液時間過長，而使細胞核難于著色的問題，得到滿意的結果。這種脫鈣方法，不僅操作簡單，而且經濟實用，效果滿意，值得推廣，對常規HE制片極其重要。經多次實驗，無論切片的質量，還是HE染色效果，此方法優于常規硝酸脫鈣處理的方法，提高了切片與染色的質量，最大程度地保存了細胞內蛋白質及酶等的結構，這對腫瘤的鑒別診斷，進一步做免疫組織化學染色及酶染色非常重要[8]，而且提高診斷的質量和縮短發報告的時間。

[1]Haritani M,Hirogari Y,Kubo M,et al.Effects of antigen retrieval pretreatments for immunohistochemistry detection of AK abane viral antigen[J].J Vet Diagn Invest,2000,12(4)：361-363.

[2]熊正文.免疫組織化學中抗原修復的研究進展[J].中華病理學雜志,1997,26(1)：124-126.

[3]Chan JK.Advances in immunohistochemistry：impact on surgical pathology practice[J].Semin Diagm pathol,2000,17(3)：170-177.

[4]熊正文,丁華野,李春光,等.脫鈣處理對骨及其軟組織免疫細胞化學染色的影響[J].診斷病理學雜志,2000,7(1)：45-47.

[5]熊正文,蘇紅,胡海霞,等.介紹一種快速的骨組織免疫組織化學染色新技術[J].國際華人醫學雜志,2000,3：62.

[6]熊正文,李春光,丁華野,等.抗原修復脫鈣組織石蠟切片抗原性后免疫組織化學染色效果的比較[J].北京軍區醫藥,1999,12：405.

[7]熊正文,孫印臣,張緒斌,等."低溫微波-硝酸快速脫鈣"技術研究及應用[J].中國實驗動物學雜志,2002,12(6)：356-358.

[8]熊正文,朱光君,李春光,等.提高骨組織免疫組織化學染色質量的若干問題探討[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2002,11：105.