腎臟損傷早期腫瘤壞死因子－α表達的實驗研究

韓曉鵬，李新源，魏登文，苗鵬程，孫少華

（1.蘭州軍區蘭州總醫院普外科，甘肅730050；2.蘭州大學醫學院第一附屬醫院病理科，甘肅730000）

隨著創傷的日益增加，腎臟損傷的發生率亦有明顯增加趨勢。腎臟損傷在泌尿系統損傷中僅次于尿道損傷而居第2位。有關創傷免疫的研究日益受到國內外學者的極大關注。本文對外源性腎上腺髓質素（ADM）對腎臟機械性損傷腫瘤壞死因子－α（TNF－α）表達的影響進行研究，進一步探討外源性ADM是否具有調節腎臟損傷后免疫失衡的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康清潔級Wistar大鼠由蘭州大學動物實驗中心提供（動物合格號：醫動字14－006），雌雄各半，體質量（210±30）g，鼠齡3個月，分籠飼養。

1.2實驗藥品及試劑 （1）固體石蠟、10%福爾馬林、蘇木素復染液、梯度乙醇、二甲苯、40mg/L水合氯醛、蒸餾水、去離子水等由蘭州大學法醫學教研室提供；（2）腎上腺髓質素（ad－renomedullin Rat1－50，ADM）購自美國 CALBIOCHEM 公司，貨號121703。TNF－α、TNF－β、TNFR一抗及SABC免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3主要儀器 （1）生物撞擊儀：自行研制［1］；（2）光學顯微鏡及顯微照相系統：日本Olympus公司；（3）計算機 Mias圖像分析系統：四川大學圖像圖形研究所；（4）切片機：德國AQ820；（5）電子分析天平：上海天平儀器廠；（6）微量加樣器（20～200 μL、0～10μL）：Labsystem 公司；（7）冰箱、恒溫電烤箱、微波爐、濕盒等。

1.4實驗動物分組 將104只Wistar大鼠隨機分為4組，即對照組（8只）、創傷組（32只）、傷前給藥組（32只）、傷后給藥組（32只）。后3組分別在打擊后1、6、12、24h各處死8只。

1.5ADM的配制與使用 ADM使用前先用0.9%生理鹽水稀釋成50nmol/L母液，置于－20℃保存。實驗時按照0.1 nmol/kg計算每只動物所需的量，再以0.9%生理鹽水稀釋為0.5mL終體積腹部注射即可。

1.6實驗動物腎臟損傷模型的制作 建立腎臟Ⅰ級損傷動物模型及采集標本，動物不經任何麻醉處理，采用臥位將其四肢固定于打擊臺上，自45cm高度處釋放160g鐵質打擊錘以自由落體下降直接打擊脊肋區，分別間接打擊雙側腎臟造成腎臟Ⅰ級損傷（根據美國創傷外科學會器官損傷標準委員會制定的腎臟損傷標準［2］）。傷前給藥組于打擊前10min及傷后給藥組于打擊后10min均腹部注射 ADM 0.1nmol/kg，各組動物均于8∶00采用快速心臟采血法處死。處死前仰臥固定，用水合氯醛（3mg/kg）深度麻醉，剪去胸腹部毛發，消毒，開胸、腹直視抽取心臟血致死。將采集到的血液迅速移入抗凝管中并輕輕搖勻備用，解剖及采血過程控制在2h以內。各組腎臟經HE染色病理組織切片觀察后符合腎臟Ⅰ級損傷標準。根據美國創傷外科學會器官損傷標準委員會指定的腎臟標準選擇打擊強度。本實驗選擇Ⅰ級損傷標準的致傷強度建立動物模型，鏡下觀察選擇標準是組織中不出現出血灶，但有紅細胞管型。

1.7組織的處理 迅速解剖動物取下腎臟標本，10%甲醛固定，經脫水、透明、石蠟包埋后，常規切片（4μm），HE染色和免疫組化染色觀察。

1.8免疫組化過程 （1）采用SABC法，將防脫片處理過的組織撈片；（2）切片于62℃烤片12h，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水；（3）熱修復抗原，將切片放入有枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）的容器中，置微波爐中加熱，中低火持續2min，取出容器冷卻至室溫；（4）用蒸餾水對切片清冼1～2次；（5）PBS洗3次，每次2min；（6）H2O2消化5～20min；（7）在室溫下用山羊血清封閉20min；（8）一抗（兔抗大鼠 TNF）4 ℃過夜；（9）0.01 mmol/L PBC漂洗3次，每次2min；（10）室溫下（20～30℃）生物素化羊抗兔IgG（二抗）20min；（11）0.01mmol/L PBC漂洗3次，每次2min；（12）室溫下（20～30℃）SABC 20min；（13）0.01mmol/L PBC 漂洗3次，每次2min；（14）DAB顯色12 min；（15）蘇木素復染；（16）脫水（同 HE染色中的相應處理）；（17）透明（同HE染色中的相應處理）；（18）封片（陰性對照用PBS代替一抗，陽性對照采用預實驗中表達較好的組織）。

1.9陽性標準 在高倍視野下出現棕黃色顆粒，特異性分布于細胞胞漿、胞核或胞膜。

1.10圖像采集分析方法 根據Kraan等標準略做修改，采用計算機圖像分析系統分別對免疫組化染色切片SAB中免疫組化染色進行計量分析。在開機20min后，用計算機圖像分析系統在10倍物鏡下采集圖像，從每張切片中隨機選取帶有1～2個近皮質腎小球的區域，作為采集圖像標準。在該視野中選取5個顯色較好且非特異性背景染色控制良好的面積近似的腎小管區域進行平均黑度值測量。數據導出為Excel格式。

1.11統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件分析及處理數據，以s表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

傷前給藥組于傷后1、12h處于高表達水平，傷后6h低表達，且較該時間點創傷組明顯降低（P＜0.05），傷后24h接近對照組水平，其余各時間點比較均無統計學意義。傷后給藥組于傷后1h明顯低于該時間點創傷組和傷前給藥組（P＜0.01，P＜0.01），傷后24h其表達明顯高于傷后1h（P＜0.01），其余時間點之間比較均無統計學意義。創傷組各時間點與對照組比較及各時間點之間比較均無統計學意義（表1、插頁Ⅱ圖1）。

圖1 各組大鼠腎組織TNF－α的表達（SABC染色×200）

表1 各組大鼠腎組織TNF－α陽性表達（s）

表1 各組大鼠腎組織TNF－α陽性表達（s）

▲：與創傷組傷后1h比較，F＝9.690，P＜0.05；■：與創傷組傷后6h比較，F＝4.365，P＜0.05；＃：與傷前給藥組同時間點比較，F＝12.236，P＜0.05。

組別 n TNF－α（黑度值）正常對照組傷后1h 8 120.040 4±8.082 3傷后6h 7 121.880 5±9.181 6傷后12h 8 111.336 9±6.657 6傷后24h 8 113.460 7±7.377 8傷前給藥組傷后1h 8 114.558 7±6.212 0傷后6h 7 107.335 9±6.305 6■傷后12h 8 116.827 9±3.923 0傷后24h 7 111.894 9±8.820 8傷后給藥組傷后1h 7 103.388 8±4.585 0▲＃傷后6h 8 112.905 0±10.864 2傷后12h 6 111.775 6±6.794 7傷后24h 8 117.575 1±5.219 7

3 討 論

ADM是于1993年從人嗜鉻細胞瘤中發現一種由52個氨基酸殘基組成的活性肽［3－5］，其具有廣泛的生物學作用：（1）可抑制致炎因子釋放；（2）有細菌脂多糖存在時能降低肺泡巨噬細胞白細胞趨化物分泌水平；（3）可提高IL－6而降低TNF－α的分泌；（4）降低炎性滲出；（5）擴張血管，增加管壁通透性，增強IL－6誘導的中性粒細胞聚集；（6）對炎癥血管反應具有抑制作用。有研究顯示，創傷性炎癥誘導T細胞產生免疫源性降鈣素基因相關肽（CGRP），可負性調節免疫細胞的功能；ADM屬于CGRP家族，具有炎癥調節作用，而致炎因子又可促使ADM自分泌而發揮作用。

近年來國內外許多學者研究發現，TNF－α與缺血再灌注損傷密切相關。TNF－α主要是由激活的單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞產生的細胞因子。TNF－α是細胞因子家族中最強效的炎癥介質，通過與2種特定的膜結合受體——TNF受體1和TNF受體2結合而發揮生物學作用。TNF－α大量表達后可通過直接的細胞毒作用，收縮血管以降低腎臟血流及聚集中性粒細胞和單核細胞等，導致腎臟細胞凋亡、腎小球纖維蛋白沉積、清蛋白濾過增加、濾過率下降、中性粒細胞浸潤等，而這些因素可進一步加重腎臟損傷。TNF－α還可能進一步導致缺血再灌注損傷后出現腎臟失去功能和細胞死亡。本實驗結果表明，創傷后1、6hTNF－α表達均高于對照組，并于6h達到峰值，12、24hTNF－α表達降低并接近對照組。說明TNF－α在創傷早期即參與了腎組織炎癥的急性期反應并加重損傷。TNF－α可促進內皮細胞表達黏附因子，增強白細胞與之黏著，促進中性粒細胞聚集和激活間質釋放蛋白水解酶誘發炎癥反應［5］。TNF－α可以刺激單核巨噬細胞和其他類型的細胞分泌IL－1、IL－6、TNF－α、IL－2等炎性細胞因子以放大或間接增強其本身的效應，這些效應加重了創傷局部的炎癥反應。另一方面滲出的炎性細胞及其釋放的蛋白水解酶促進了創傷壞死組織的吞噬和分解，有利于壞死組織的清除和創傷的修復，減少TNF－α的釋放，故表現在本實驗創傷組中12、24hTNF－α表達降低并接近對照組。創傷組各時間點與對照組比較及各時間點之間比較差異均無統計學意義，提示TNF－α參與炎癥的過程既有放大本身的效應，又可間接地減少自身的釋放。

傷前給藥組TNF－α表達于傷后1、12h處于高表達水平。傷后6h低表達，且較該時間點創傷組明顯降低（P＜0.05），傷后24h接近對照組水平，其余各時間點比較差異均無統計學意義。血循環中ADM以20min的半衰期 迅速代謝［6］。傷前10min注射，外源性ADM剛好處于半衰期內，與機體遭受創傷時產生的內源性ADM一起對創傷器官發揮了良好的保護作用。傷前給藥組TNF－α在1、6h的表達低于創傷組同時間點的表達，并與6h比較差異有統計學意義。證實了ADM能降低巨噬細胞白細胞趨化物分泌水平，降低TNF－α分泌。此效應及時地下調了急性創傷后TNF－α的級聯放大作用，避免創傷對腎臟組織的過度損害。

傷后給藥組TNF－α的表達于傷后1h明顯低于該時間點創傷組和傷前給藥組（P＜0.01）。說明創傷后注射ADM可明顯抑制TNF－α在傷后1h的表達，且其效果優于創傷前給藥。傷后24hTNF－α表達明顯高于傷后1h（P＜0.01）。分析其原因可能是傷后24h外源性ADM基本已完全代謝，僅有內源性ADM發揮效應。

血漿中ADM主要來源于血管內皮細胞（VEC）和血管平滑肌細胞（VSMC），正常人血漿ADM濃度較低，大多為具有免疫反應性的ADM－gly，它是ADM的一種中間形式，這也反映了 ADM 在組織中的產生過程［7］。IL－1β、TNF－α、脂 多糖（LPS）、內皮素－1（ET－1）、血管緊張素－Ⅱ均可刺激 VSMC分泌ADM，而ADM能降低TNF－α的分泌，抑制TNF－α的級聯放大作用，本實驗結果與多數學者觀點相吻合。

TNF－α是一種具有多種生物學功能的炎性細胞因子，參與了腎臟損傷的炎癥發展過程，隨著對TNF－α研究的深入，可能為揭示腎臟損傷的發病機制提供新的理論依據，并為治療腎臟損傷性疾病提供新的手段，如采用控制TNF－α產生量、中和TNF－α觸發的細胞反應來防止TNF－α所引起的組織損傷，利用轉基因技術直接在炎癥部位使TNF－α等炎癥介質失去生物學活性等。

［1］蒙伶俐，孫少華，張軍榮，等.經體表創傷后腎臟組織中缺氧誘導因子－1α表達的調控［J］.第四軍醫大學學報，2005，26（14）：1311.

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［3］Liu J，Chen M，Wang X.Calcitonin gene－related peptide inhibits lipopolysaccharide－induced interleukin 12release from mouse peritoneal macrophages，mediated by the cAMP pathway［J］.Immunology，2000，101（1）：61.

［4］蔡大勇，唐朝樞.腎上腺髓質素的抗感染和炎癥調節作用［J］.中國病理生理雜志，2005，21（3）：614.

［5］Noiri E，Nakao A.Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2001，281：948.

［6］Betowski J，Jamroz A.Adrenomedullin－what do we know 10years since its discovery［J］.Pol J Pharmacol，2004，56（1）：27.

［7］Kitamura K，Kato J，Kawamoto M，et al.The intermediate form of glycine－extended adrenomedullin is the major circulating molecular form in human plasma［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，244（2）：551.