左卡尼汀對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠ATP酶活性的影響

韓征宇,李光來(lái)

左卡尼汀(Levocarnitine),也稱左旋肉堿,是一種廣泛存在于機(jī)體組織內(nèi)的特殊氨基酸,其基本生理功能是轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞線粒體,通過(guò)β-氧化進(jìn)入三羧酸循環(huán),為細(xì)胞提供能量,且通過(guò)新型有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(OCTN2)很容易通過(guò)血腦屏障[1]。本研究采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,觀察左卡尼汀對(duì)缺血再灌注模型大鼠腦組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、總ATPase活性的影響,探討其腦保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 選用健康雄性W istar大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)40只,鼠齡3個(gè)月～4個(gè)月,體重250 g±15 g。左卡尼汀(珠海億邦制藥有限公司,批號(hào)20090102);ATP酶試劑(南京建成生物工程研究所提供);普通試劑由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 健康雄性Wistar大鼠40只,隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、生理鹽水對(duì)照組(B組)、左卡尼汀100 mg/kg治療組(C組)、左卡尼汀200 mg/kg治療組(D組),每組10只。B組、C組、D組制作模型前30 m in分別以生理鹽水1 m L,左卡尼汀100mg/kg、200mg/kg腹腔注射。

1.2.2 右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型的建立 采用改良Longa法[2]建立大鼠腦缺血再灌注模型。將大鼠用10%水合氯醛3 m l/kg腹腔麻醉,頸正中右旁開(kāi)0.5 cm～1.0 cm切口,鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈,結(jié)扎頸外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈近心端,在頸總動(dòng)脈距離分岔口大約5 cm處用眼科剪剪開(kāi)一小口,將直徑0.236mm的進(jìn)口尼龍魚線插入,以分岔口處開(kāi)始測(cè)量距離,插入1.8 cm～2.0 cm后固定魚線,縫合。缺血2 h后將線栓拉出1 cm左右即可,形成再灌注。其中假手術(shù)組插入1.0 cm魚線,其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。神經(jīng)功能缺損評(píng)分:按照Longa等[2]的5級(jí)4分法標(biāo)準(zhǔn),神經(jīng)功能缺損評(píng)分在1分～3分者入選。

1.2.3 標(biāo)本及病理切片的制備 左卡尼汀各劑量組、生理鹽水對(duì)照組在缺血2 h再灌注24 h,假手術(shù)組在24 h后,頸椎脫臼處死,迅速取腦,各組隨機(jī)取兩只大鼠右側(cè)腦組織迅速固定,石蠟包埋后,在海馬部位做矢狀切片,厚約5μm,HE染色,觀察組織學(xué)變化。

1.2.4 腦組織勻漿的制備與指標(biāo)的檢測(cè) 將腦組織用生理鹽水漂洗,除去血液,濾紙拭干,精確稱重后制備10%勻漿。低溫離心機(jī)將勻漿以3 500 r/min離心15 m in,取上清液檢測(cè)ATP酶,嚴(yán)格按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件包,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下HE染色結(jié)果 假手術(shù)組大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常。生理對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞變性壞死明顯,胞體腫脹,周圍間隙增寬,結(jié)構(gòu)不清,出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核溶解。左卡尼汀各劑量組神經(jīng)細(xì)胞呈輕度缺血改變,變性壞死不明顯,胞體呈輕度腫脹,神經(jīng)細(xì)胞缺失較生理對(duì)照組輕。

2.2 腦組織ATP酶活性的變化 與A組比較,B組3種ATP酶的活性均明顯降低(P＜0.01)。C組、D組與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 左卡尼汀對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織ATP酶活性變化的影響(±s)μmol/(m gprot?h)

表1 左卡尼汀對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織ATP酶活性變化的影響(±s)μmol/(m gprot?h)

組別n Na+-K+-ATPase Ca2+-Mg2+-ATPase總ATPase A組6 10.266±0.993 6.501±0.538 20.569±2.059 B組6 7.258±0.5051)3.821±0.5011)14.800±1.2181)C組6 8.585±0.8151)3)5.876±0.5692)3)18.514±1.5572)3)D組6 9.075±0.7192)3)6.134±0.6673)19.370±1.7313)與A組比較,1)P＜0.01,2)P＜0.05;與B組比較,3)P＜0.01

3 討 論

缺血性腦損傷的病因和病變機(jī)制十分復(fù)雜,其中能量耗竭被認(rèn)為是缺血性神經(jīng)元損傷的始動(dòng)因素。腦缺血再灌注后細(xì)胞能量代謝障礙可使腦細(xì)胞內(nèi)ATP逐漸耗竭,依靠ATP運(yùn)轉(zhuǎn)的離子泵(Na+-K+-ATPase)因能量障礙而受到抑制,同時(shí)因Na+-K+-ATPase和Ca2+-M g2+-ATPase活性降低,導(dǎo)致胞內(nèi)Na+和Ca2+超載。細(xì)胞內(nèi)Na+增多,導(dǎo)致滲透壓升高,是再灌注早期腦細(xì)胞內(nèi)水腫和神經(jīng)細(xì)胞壞死的重要原因[3]。細(xì)胞內(nèi)Na+增多,Na+-Ca2+交換增多,進(jìn)一步加重細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,引起自由基產(chǎn)生增多,使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞膜通透性增加,細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境失去平衡,最后導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。本研究顯示,大鼠腦缺血再灌注后腦組織ATP酶活性均明顯較假手術(shù)組降低(P＜0.01)。ATP酶活性被認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜功能狀態(tài)的標(biāo)記,其活性已成為間接反映細(xì)胞能量代謝情況及腦缺血損傷程度評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

左卡尼汀是線粒體脂肪酸β-氧化產(chǎn)生能量的重要輔因子,最近國(guó)外研究發(fā)現(xiàn),脂肪酸也作為一個(gè)重要能量底物被大腦使用,大腦中13碳-辛酸酯(13C-octanoate)氧化產(chǎn)生能量幾乎占大腦總能量的20%[4]。腦缺血后補(bǔ)充左卡尼汀可降低游離脂肪酸濃度,使堆積的脂酰CoA進(jìn)入線粒體內(nèi),進(jìn)行β氧化,產(chǎn)生ATP供能[5]。左卡尼汀能降低腦乳酸/丙酮酸比率,提高丙酮酸脫氫酶的活力,促進(jìn)葡萄糖的氧化利用,改善預(yù)后的神經(jīng)功能[6]。在體外神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)缺血缺氧模型中,左卡尼汀可保持呼吸鏈復(fù)合物的活性,提高呼吸鏈的代謝,保護(hù)線粒體的蛋白質(zhì),對(duì)抗線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激,促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C氧化酶的活性,促進(jìn)線粒體ATP的產(chǎn)生,對(duì)缺血神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[7,8]。Alves等[9]研究表明,左卡尼汀對(duì)抗MDMA(二亞甲基雙氧苯丙胺)的神經(jīng)毒性作用,降低線粒體m tDNA缺失,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示,缺血前0.5 h腹腔注射左卡尼汀能使降低的ATPase活性不同程度的恢復(fù),提示左卡尼汀提高腦組織ATP酶活性,減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。左卡尼汀對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制可能有:通過(guò)促進(jìn)腦缺血再灌注后線粒體脂肪酸代謝,提高糖代謝,加速ATP產(chǎn)生,及早恢復(fù)缺血半暗區(qū)能量供應(yīng),阻斷后續(xù)的鏈?zhǔn)缴窠?jīng)元損傷反應(yīng),產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。Na+-K+-A TPase活性升高可糾正細(xì)胞內(nèi)酸中毒,Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高可糾正Ca2+超載,左卡尼汀通過(guò)提高腦缺血再灌注后Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性,維持鈉泵、鈣泵的穩(wěn)定,使細(xì)胞內(nèi)外Na+、Ca2+平衡,從而穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞膜電位,起到神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。關(guān)于左卡尼汀在神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的其他相關(guān)機(jī)制,尚有待于進(jìn)一步研究。

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