高效液相色譜法測(cè)定飼料香味劑中香芹酚和百里香酚含量的研究

遼寧省獸藥飼料監(jiān)察所 楊希國 李永才

香芹酚和百里香酚是 《飼料添加劑品種目錄（2008）》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1126號(hào)）規(guī)定的允許在養(yǎng)殖動(dòng)物中使用的飼料香料劑。目前尚無檢測(cè)飼料香味劑中香芹酚和百里香酚的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及報(bào)道。本研究建立了飼料香味劑中香芹酚和百里香酚含量測(cè)定的高效液相色譜法，本方法操作簡便、準(zhǔn)確可靠、選擇性好，為香味劑的檢測(cè)提供了技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)方法

1.1 儀器 Waters 2695型液相色譜儀 （配二極管陣列檢測(cè)器）；超聲波清洗器；電子天平（精度0.0001 g和 0.00001 g）。

1.2 試劑和溶液 冰醋酸、甲醇為色譜純；95%乙醇為分析純；香芹酚（Sigma公司，純度98%）；百里香酚（Sigma公司，純度99%）；流動(dòng)相：甲醇+水+冰醋酸（60+40+2）；標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取香芹酚500 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為10 mg/mL的香芹酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密稱取百里香酚500 mg，置50 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為10 mg/mL的百里香酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液。臨用前，將香芹酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)貯備 液 用 甲 醇 稀 釋 成 濃 度 為 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、200.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL 的 標(biāo) 準(zhǔn) 工 作液。

1.3 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱（粒度為 5 μm，柱長 250 mm，內(nèi)徑 5 mm）；流速為0.7 mL/min；檢測(cè)波長為 274 nm；進(jìn)樣體積為 20 μL；柱溫為 30 ℃。

1.4 樣品測(cè)定

1.4.1 樣品提取 稱取飼料香味劑樣品2 g（精確至0.0001 g），置于250 mL容量瓶中，加甲醇超聲提取30 min，定容，過0.45 μm的濾膜，供液相色譜測(cè)定。

1.4.2 樣品測(cè)定 取20 μL處理好的樣品注入高效液相色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以峰面積外標(biāo)法定量。

1.5 回收率及精密度測(cè)定 精密稱取飼料香味劑2 g，置于250 mL容量瓶中，添加香芹酚和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按1.4方法測(cè)定，計(jì)算回收率和精密度。

1.6 定量限測(cè)定 添加不同水平香芹酚和百里香酚的飼料香味劑，按1.4方法檢測(cè)，定量限以信噪比大于等于10（S/N≥ 10）計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 波長選擇 取0.1 mg/mL的香芹酚和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長掃描，結(jié)果在274.5 nm處有最大吸收波長（見圖1）。用274 nm檢測(cè)時(shí)無雜質(zhì)峰干擾，香芹酚和百里香酚能完全分離。

圖1 香芹酚和百里香酚波長掃描圖譜

2.2 色譜圖 標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見圖2。圖2表明，香芹酚和百里香酚得到了很好的基線分離，峰形對(duì)稱，無雜質(zhì)峰干擾。

2.3 線性關(guān)系考察 配制濃度為 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、200.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL 的香芹酚和百里香酚系列標(biāo)準(zhǔn)工作液后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果香芹酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=23600X+7664.8，百里香酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=23787X+7740.1，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，結(jié)果表明，香芹酚和百里香酚在1.0～500.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 回收率和精密度測(cè)定結(jié)果 對(duì)某樣品進(jìn)行了11次測(cè)定，結(jié)果香芹酚和百里香酚的平均含量分別為23.5 mg/g和22.8 mg/g。對(duì)該樣品進(jìn)行了添加回收率實(shí)驗(yàn)。稱取2 g樣品，加入5 mg香芹酚和百里香酚，結(jié)果見表1。測(cè)得香芹酚的回收率為96.8% ～99.2%，平均回收率為98.2%，變異系數(shù)為1.0%；百里香酚的回收率為97.6%～101.4%，平均回收率為99.5%，變異系數(shù)為1.6%，該方法回收率高、重現(xiàn)性好。

2.5 定量限測(cè)定結(jié)果 添加不同水平香芹酚和百里香酚的飼料香味劑，按上述方法檢測(cè)，當(dāng)添加水平為50 mg/kg時(shí)，其信噪比均大于10（S/N>10），因此，確定方法的定量限為50 mg/kg。

表1 香芹酚和百里香酚的添加回收率和精密度

3 討論

3.1 提取 香芹酚和百里香酚均能溶于醇、醚和堿溶液等，不溶或微溶于水。本研究分別考察了甲醇、無水乙醇和95%乙醇對(duì)飼料香味劑中香芹酚和百里香酚的超聲提取效果，結(jié)果表明無水乙醇和95%乙醇提取的回收率相仿，略低于甲醇提取的回收率。超聲時(shí)間30 min以上提取效果幾乎無變化。故選甲醇超聲提取30 min為樣品提取方法，此方法回收率高，樣品雜質(zhì)少，對(duì)檢測(cè)無干擾。

3.2 檢測(cè)條件 香芹酚和百里香酚屬同分異構(gòu)體，其沸點(diǎn)相差約5℃，氣相色譜分離較難；本研究采用高效液相色譜法Symmetry C18色譜柱分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，考察了甲醇+水+冰醋酸（60+40+2）和乙腈+水（65+35）作為流動(dòng)相的檢測(cè)效果，結(jié)果顯示乙腈和水作為流動(dòng)相色譜峰的對(duì)稱性差，而甲醇、水和冰醋酸混合作為流動(dòng)相香芹酚和百里香酚得到了很好的基線分離，峰形對(duì)稱，無雜質(zhì)干擾。

4 結(jié)論

高效液相色譜法檢測(cè)飼料香味劑香芹酚和百里香酚，具有線性關(guān)系良好、回收率高、變異小的特點(diǎn)，對(duì)飼料香味劑香芹酚和百里香酚定量分析準(zhǔn)確可靠，可以推薦用于飼料香味劑中香芹酚和百里香酚的檢測(cè)。