高效液相色譜法測定大補陰丸中鹽酸小檗堿的含量

蔡鈴英 陳子春

福建中醫學院附屬寧德市醫院，福建 寧德 352100

大補陰丸由熟地黃、鹽黃柏、鹽知母、龜甲、豬脊髓五味藥物組成，具有滋陰降火的功效，用于陰虛火旺、潮熱盜汗、咳嗽咯血、耳鳴遺精等癥。方中鹽黃柏具有滋陰降火的功效，用于陰虛火旺、盜汗骨蒸等癥；其主要成分為鹽酸小檗堿，現采用高效液相色譜法測定大補陰丸中鹽酸小檗堿的含量來確定制劑中鹽黃柏的含量，方法簡便，結果準確可靠，可用于大補陰丸的質量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1100系列高效液相色譜儀（包括四元梯度泵；紫外檢測器；Agilent工作站）BP211D電子分析天平（Sartorius）。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號0713-200608）甲醇為色譜，純水為超純水；其他試劑均為分析純；大補陰丸為市售。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18色譜柱（250mm×4.6mm，4μm）；流動相為磷酸鹽緩沖液[0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液和0.05mol/L十二烷基磺酸鈉溶液（1∶1）]-甲醇（70∶30）；流速：1.0ml/min；檢測波長265nm，柱溫為30℃；進樣量；10μl；理論板數按鹽酸小檗堿峰計算，應不低于4000。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.18mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每ml含101.8μg的溶液，作為對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液1.3.5.10.15.20ml置50mL量瓶中，加甲醇制成濃度為2.036，6.108，10.18，20.36，30.54，40.72μg/ml的對照品系列濃度溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品（水蜜丸）適量，研細，取1g精密稱定，置索氏提取器中精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液適量，加熱回流提取至提取液無色，將提取液移至100ml量瓶中，用少量上述混合溶液洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加上述混合液至刻度，搖勻，精密量取5ml至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，作為供試品溶液。

2.4 線性關系考察 取2.2項下對照品系列濃度溶液，按2.1色譜條件進行測定，測得峰面積，以濃度（C）對峰面積（A）積分值進行線性回歸，求得回歸方程為A=48.237C+0.8431，r=0.9995。表明鹽酸小檗堿在2.036-40.72μg/ml濃度范圍內，線性良好。

2.5 空白實驗 按照中國藥典2005年版處方比例及制法制成不含黃柏的樣品，并按供試品的制法制成陰性對照溶液，依法進行測定，結果陰性對照品溶液在鹽酸小檗堿保留時間處無色譜峰出現（見圖l），表明該實驗條件下，其他藥材成分對測定無干擾。

圖l 對照品及樣品的HPLC圖譜

2.6 穩定性實驗 取樣品按2.3項下方法制備供試品溶液，在0、3、6、9、12h進樣檢測，測得結果RSD為1.03%，表明樣品溶液在12h內基本穩定。

2.7 重復性實驗 取同一樣品5份按2.3項下方法制得供試品溶液，依法進樣檢測，分別測定含量，RSD為0.92%。

2.8 精密度實驗 取實驗用對照品溶液，分別連續進樣5次，RSD為0.32%。結果表明儀器運行良好。

2.9 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的供試品（批號20080607）1g，共6份，分別精密加入一定量的鹽酸小檗堿對照品溶液，依法提取測定。

2.10 樣品測定 取二個廠家樣品4批，制成供試品溶液，分別測定吸收峰面積，按外標法計算鹽酸小檗堿含量，結果如下

樣品含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 通過含量測定結果可見廠家及各批號的產品間的含量存在差異，這可能與原料藥有關；在舊版藥典中黃柏與關黃柏合并做為黃柏使用，新版藥典中才分列使用，而二者的含量差別懸殊，市場上混用比較嚴重，成方制劑中有必要增加對其含量的考察。

3.2 經比較索氏回流提取法比超聲波提取法含量高，而且所測定的目標成分為有色物質，以回流液無色作為提取終點，有利于判斷，實驗證明，該法提取完全，回收率較好。

3.3 試驗采用十二烷基磺酸鈉作為離子對試劑，能與目標成分結合形成離子對，從而減少硅醇基的影響。經實驗證明，離子對試劑的使用，有助改善組分的分離。

[1] 國家藥典委員會編.中國藥典[S].北京：化學工業出版社，2005：214－329.