馬鈴薯遺傳多樣性的ISSR分析

田大翠，朱宏波，郭建夫，黃建堂

（廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

馬鈴薯是世界第4大糧食作物，也是我國重要的糧食及大宗蔬菜作物，隨著世界人口的急劇增加、耕地面積的減少、大宗糧食作物種植效益的不斷下降以及水資源短缺和膳食結(jié)構(gòu)的改善，馬鈴薯的重要性和馬鈴薯育種的緊迫性也日益顯現(xiàn)。馬鈴薯屬同源四倍體作物，以無性繁殖為主,遺傳復(fù)雜[1]。馬鈴薯育種目前仍以品種間雜交育種和芽變育種為主[2]。對馬鈴薯種質(zhì)資源的正確評價是育種的關(guān)鍵。

中國馬鈴薯種質(zhì)資源的研究還很落后，且主要應(yīng)用的手段是形態(tài)比較、細(xì)胞學(xué)觀察等[1]，而分子水平的鑒定研究工作進(jìn)行的較少。邸宏等[3]利用RAPD和AFLP標(biāo)記分析了中國主要馬鈴薯的遺傳多樣性，認(rèn)為中國馬鈴薯主栽品種從遺傳組成上差異小，遺傳多樣性差，親本來源單一,遺傳基礎(chǔ)較為狹窄。李鳳云等[4]利用RAPD和AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對19份克新系列馬鈴薯品種進(jìn)行遺傳分析，認(rèn)為克新系列馬鈴薯品種遺傳基礎(chǔ)有所拓寬。何鳳發(fā)等[5]利用SRAP分子標(biāo)記對44份馬鈴薯的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，將所選品種在血統(tǒng)上分為了四大類群。姚國勝等[6]利用SSR分子標(biāo)記對來自河北和黑龍江兩個省份的58個馬鈴薯晚疫病菌株基因組DNA進(jìn)行SSR基因型鑒定，分別將兩省的菌株分為4個和2個SSR基因型。利用分子標(biāo)記手段對種質(zhì)資源進(jìn)行準(zhǔn)確、科學(xué)的鑒定和評價，明晰材料的遺傳基礎(chǔ)，可為育種工作提供分子依據(jù)，對馬鈴薯種質(zhì)資源的收集、保存和利用都具有重要的意義。

本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對中國各地馬鈴薯品種和部分國外品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，從分子水平分析中國各地馬鈴薯品種間遺傳關(guān)系及遺傳基礎(chǔ)，為馬鈴薯品種的進(jìn)一步開發(fā)和利用以及種質(zhì)鑒定提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料品種和來源見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA制備

采用SDS法提取馬鈴薯基因組DNA[7]。

1.2.2 PCR反應(yīng)與電泳

引物和dNTPs由上海生工合成，Taq DNA聚合酶為實驗室自產(chǎn)。采用20 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系：Taq 酶 0.3 μL（1U），2 μL 的10 ×PCR Buffer（含Mg2+），模板DNA 1 μL(1 ug)，10 mM dNTP 0.15 μL，引物 1 μL，加水補(bǔ)齊至 20 μL。擴(kuò)增參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行40個循環(huán)：94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，最后72℃延伸5 min，20℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在5%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離、銀染、讀帶。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

電泳結(jié)果的每條DNA譜帶為1個單位，同一ISSR位點(diǎn)上有帶的賦值為1，無帶的賦值為0，統(tǒng)計結(jié)果以1、0矩陣輸入計算機(jī)，建立數(shù)據(jù)庫，用NTSYS-ps軟件處理數(shù)據(jù)，并對材料進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

從60條ISSR引物中篩選出10條能夠在馬鈴薯基因組DNA中擴(kuò)增出清晰條帶的引物（表2）。10條引物共計擴(kuò)增出57條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶48條，多態(tài)率為84.21%，不同引物擴(kuò)增的多態(tài)比率分布在50%～100%，引物的PIC值平均為0.2055。每個引物擴(kuò)增的DNA條帶數(shù)在2～13之間，平均5.7條。擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物為UBC 850，達(dá)13條，擴(kuò)增條帶數(shù)最少的引物為UBC 807和UBC 812，擴(kuò)增條帶為2條（圖1）。

表1 試驗材料來源與編號Table1 The origin and code number of materials

表2 ISSR分析所用引物序列和擴(kuò)增結(jié)果Table2 The primers alignment and amplified results of ISSR analysis

圖1 引物UBC 850在不同馬鈴薯材料中的ISSR圖譜Figure1 Electrophoresis diagram of different potatoes by ISSR primer UBC850

圖2 20份馬鈴薯材料基于ISSR分析的UPGMA聚類圖Figure2 Dendrogram of 20 potatoes varieties based on ISSR markers

2.2 聚類分析

聚類分析結(jié)果如表3，20份馬鈴薯材料的遺傳相似系數(shù)在0.5263～0.9825之間，平均相似系數(shù)為0.7220，其中克新13號和克新21號之間遺傳相似系數(shù)最大，為0.9825，其次是241和克新13號，為0.9474，說明它們的親緣關(guān)系非常近。遺傳相似系數(shù)最小的是克新20號和富金，為0.5263，其次是富金和DD419，為0.5439。富金和中薯1號，黑美人和YN-1，中薯1號和克新16號之間也比較小，為 0.5965，表明它們之間遺傳差異較大。總體上來說，所選擇的馬鈴薯材料間的親源關(guān)系比較遠(yuǎn)，反映出中國馬鈴薯品種的遺傳關(guān)系比較遠(yuǎn)，在育種上可以利用的空間比較大。

通過聚類分析可知（圖2），在相似系數(shù)為0.73附近，20份馬鈴薯材料分為五大類，富金單獨(dú)是一類，第二類有2個品種，即克新17號和黑美人，大西洋和YN-1為第三大類，克新20號和中薯1號為第四類，其余歸到第五大類。第五大類又可以分為三個亞類。抗青9-1與來自荷蘭的品種費(fèi)烏瑞它親緣關(guān)系較近，克新系列相對較集中，且多和Mira、Epoka有親緣關(guān)系，但克新17號和黑美人有血緣關(guān)系，克新20號有了Fortuna的血緣，說明克新系列也在不斷的拓展其親本來源。而作為富金的父本，尤金并沒有和富金聚在一起，這可能是因為其多倍體的特點(diǎn)使得尤金在作父本時所產(chǎn)生的配子具有了遺傳差異。

3 討論

3.1 ISSR分子標(biāo)記用于馬鈴薯遺傳多樣性的分析

ISSR標(biāo)記作為以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，除了具有操作簡單的優(yōu)點(diǎn)外，還具有穩(wěn)定和多態(tài)條帶豐富的優(yōu)點(diǎn)，近年來在遺傳多樣性分析領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[8-11]。本試驗利用10條ISSR引物將20份馬鈴薯材料完全區(qū)分開來，試驗結(jié)果與前人基本一致，說明ISSR分子標(biāo)記適用于馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析。另外，我們在讀帶的時候只讀取了完全清晰可辨的條帶，雖然這在一定程度上會降低條帶的豐富性，但卻保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 國內(nèi)馬鈴薯品種的遺傳多樣性研究

已有研究表明，我國馬鈴薯主栽品種整體上遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，遺傳組成上差異小，遺傳多樣性差，且存在地域差異小的特點(diǎn)，不同地方品種間的交流比較小。本研究表明，我國既有品種中有許多和現(xiàn)在的主栽品種之間遺傳差異還是很大，馬鈴薯育種工作中應(yīng)該加強(qiáng)對這些品種和一些野生資源的利用，盡量拓寬親本的來源[12-13]。隨著馬鈴薯育種研究的不斷發(fā)展，地方品種間的交流將更加密切，野生種和來自國外的優(yōu)良品種在中國馬鈴薯育種中將發(fā)揮巨大作用。

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