馬鈴薯遺傳多樣性的ISSR分析

田大翠，朱宏波，郭建夫，黃建堂

（廣東海洋大學農學院，廣東 湛江 524088）

馬鈴薯是世界第4大糧食作物，也是我國重要的糧食及大宗蔬菜作物，隨著世界人口的急劇增加、耕地面積的減少、大宗糧食作物種植效益的不斷下降以及水資源短缺和膳食結構的改善，馬鈴薯的重要性和馬鈴薯育種的緊迫性也日益顯現。馬鈴薯屬同源四倍體作物，以無性繁殖為主,遺傳復雜[1]。馬鈴薯育種目前仍以品種間雜交育種和芽變育種為主[2]。對馬鈴薯種質資源的正確評價是育種的關鍵。

中國馬鈴薯種質資源的研究還很落后，且主要應用的手段是形態比較、細胞學觀察等[1]，而分子水平的鑒定研究工作進行的較少。邸宏等[3]利用RAPD和AFLP標記分析了中國主要馬鈴薯的遺傳多樣性，認為中國馬鈴薯主栽品種從遺傳組成上差異小，遺傳多樣性差，親本來源單一,遺傳基礎較為狹窄。李鳳云等[4]利用RAPD和AFLP分子標記技術對19份克新系列馬鈴薯品種進行遺傳分析，認為克新系列馬鈴薯品種遺傳基礎有所拓寬。何鳳發等[5]利用SRAP分子標記對44份馬鈴薯的遺傳多樣性進行了分析，將所選品種在血統上分為了四大類群。姚國勝等[6]利用SSR分子標記對來自河北和黑龍江兩個省份的58個馬鈴薯晚疫病菌株基因組DNA進行SSR基因型鑒定，分別將兩省的菌株分為4個和2個SSR基因型。利用分子標記手段對種質資源進行準確、科學的鑒定和評價，明晰材料的遺傳基礎，可為育種工作提供分子依據，對馬鈴薯種質資源的收集、保存和利用都具有重要的意義。

本研究利用ISSR分子標記技術，對中國各地馬鈴薯品種和部分國外品種進行遺傳多樣性分析，從分子水平分析中國各地馬鈴薯品種間遺傳關系及遺傳基礎，為馬鈴薯品種的進一步開發和利用以及種質鑒定提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料品種和來源見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA制備

采用SDS法提取馬鈴薯基因組DNA[7]。

1.2.2 PCR反應與電泳

引物和dNTPs由上海生工合成，Taq DNA聚合酶為實驗室自產。采用20 μL的反應體系進行PCR擴增,反應體系：Taq 酶 0.3 μL（1U），2 μL 的10 ×PCR Buffer（含Mg2+），模板DNA 1 μL(1 ug)，10 mM dNTP 0.15 μL，引物 1 μL，加水補齊至 20 μL。擴增參數為：94℃預變性5 min，然后進行40個循環：94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，最后72℃延伸5 min，20℃終止反應。PCR產物在5%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離、銀染、讀帶。

1.2.3 數據分析

電泳結果的每條DNA譜帶為1個單位，同一ISSR位點上有帶的賦值為1，無帶的賦值為0，統計結果以1、0矩陣輸入計算機，建立數據庫，用NTSYS-ps軟件處理數據，并對材料進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 多態性分析

從60條ISSR引物中篩選出10條能夠在馬鈴薯基因組DNA中擴增出清晰條帶的引物（表2）。10條引物共計擴增出57條DNA條帶，其中多態性條帶48條，多態率為84.21%，不同引物擴增的多態比率分布在50%～100%，引物的PIC值平均為0.2055。每個引物擴增的DNA條帶數在2～13之間，平均5.7條。擴增條帶數最多的引物為UBC 850，達13條，擴增條帶數最少的引物為UBC 807和UBC 812，擴增條帶為2條（圖1）。

表1 試驗材料來源與編號Table1 The origin and code number of materials

表2 ISSR分析所用引物序列和擴增結果Table2 The primers alignment and amplified results of ISSR analysis

圖1 引物UBC 850在不同馬鈴薯材料中的ISSR圖譜Figure1 Electrophoresis diagram of different potatoes by ISSR primer UBC850

圖2 20份馬鈴薯材料基于ISSR分析的UPGMA聚類圖Figure2 Dendrogram of 20 potatoes varieties based on ISSR markers

2.2 聚類分析

聚類分析結果如表3，20份馬鈴薯材料的遺傳相似系數在0.5263～0.9825之間，平均相似系數為0.7220，其中克新13號和克新21號之間遺傳相似系數最大，為0.9825，其次是241和克新13號，為0.9474，說明它們的親緣關系非常近。遺傳相似系數最小的是克新20號和富金，為0.5263，其次是富金和DD419，為0.5439。富金和中薯1號，黑美人和YN-1，中薯1號和克新16號之間也比較小，為 0.5965，表明它們之間遺傳差異較大。總體上來說，所選擇的馬鈴薯材料間的親源關系比較遠，反映出中國馬鈴薯品種的遺傳關系比較遠，在育種上可以利用的空間比較大。

通過聚類分析可知（圖2），在相似系數為0.73附近，20份馬鈴薯材料分為五大類，富金單獨是一類，第二類有2個品種，即克新17號和黑美人，大西洋和YN-1為第三大類，克新20號和中薯1號為第四類，其余歸到第五大類。第五大類又可以分為三個亞類。抗青9-1與來自荷蘭的品種費烏瑞它親緣關系較近，克新系列相對較集中，且多和Mira、Epoka有親緣關系，但克新17號和黑美人有血緣關系，克新20號有了Fortuna的血緣，說明克新系列也在不斷的拓展其親本來源。而作為富金的父本，尤金并沒有和富金聚在一起，這可能是因為其多倍體的特點使得尤金在作父本時所產生的配子具有了遺傳差異。

3 討論

3.1 ISSR分子標記用于馬鈴薯遺傳多樣性的分析

ISSR標記作為以PCR為基礎的分子標記，除了具有操作簡單的優點外，還具有穩定和多態條帶豐富的優點，近年來在遺傳多樣性分析領域被廣泛應用[8-11]。本試驗利用10條ISSR引物將20份馬鈴薯材料完全區分開來，試驗結果與前人基本一致，說明ISSR分子標記適用于馬鈴薯種質資源遺傳多樣性的分析。另外，我們在讀帶的時候只讀取了完全清晰可辨的條帶，雖然這在一定程度上會降低條帶的豐富性，但卻保證了結果的準確性。

3.2 國內馬鈴薯品種的遺傳多樣性研究

已有研究表明，我國馬鈴薯主栽品種整體上遺傳基礎較為狹窄，遺傳組成上差異小，遺傳多樣性差，且存在地域差異小的特點，不同地方品種間的交流比較小。本研究表明，我國既有品種中有許多和現在的主栽品種之間遺傳差異還是很大，馬鈴薯育種工作中應該加強對這些品種和一些野生資源的利用，盡量拓寬親本的來源[12-13]。隨著馬鈴薯育種研究的不斷發展，地方品種間的交流將更加密切，野生種和來自國外的優良品種在中國馬鈴薯育種中將發揮巨大作用。

[1]劉福翠,譚學林,郭華春.云南省馬鈴薯品種資源的RAPD分析[J].西南農業學報,2004,17:200-204.

[2]戴朝曦.用生物技術改革馬鈴薯育種方法[C].甘肅省遺傳學會論文集,1993:6-12.

[3]邸宏,陳伊里,金黎平,等.RAPD和AFLP標記分析中國馬鈴薯主要品種的遺傳多樣性[J].作物學報,2006,32(6):899-904.

[4]李鳳云,盛萬民,劉昭軍.馬鈴薯品種遺傳多樣性的RAPD和AFLP標記分析[J].中國馬鈴薯,2007,21(5):266-270.

[5]何鳳發,楊志平,張正圣,等.馬鈴薯遺傳資源多樣性的SRAP分析[J].農業生物技術學報,2007,15(6):1001-1005.

[6]姚國勝,王俊山,楊英茹,等.河北省和黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型分析[J].科技導報,2008,26(5):35-39.

[7]彭鎖堂,莊杰云,顏啟傳,等.我國主要雜交水稻組合及其親本SSR標記和純度鑒定[J].中國水稻科學,2003,17(1):1-5.

[8]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome finger-printing by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20:176-183.

[9]毛偉海,杜黎明,包崇來,等.我國南方長茄種質資源的ISSR標記分析[J].園藝學報,2006,3(5):1109-1112.

[10]鄭玉紅,夏冰,杭悅宇,等.黃獨遺傳多樣性研究[J].西北植物學報,2006,26(10)： 2011-2017.

[11]馬艷明,李斯深,范玉頂,等.黃淮麥區小麥品種(系)的ISSR位點遺傳多樣性分析[J].植物遺傳資源學報,2006,7(1)：13-17.

[12]邸宏,陳伊里.AFLP技術在馬鈴薯育種中的應用[J].中國馬鈴薯,2004,18(2):98-101.

[13]宋吉軒,范士杰,鄧寬平,等.分子標記技術在馬鈴薯育種中的應用[J].貴州農業科學,2006,34(5):72-75.