快速、準(zhǔn)確鑒別產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的新方法

胡 曉， 張 敏， 劉彭強(qiáng)， 鄧秋蕾， 舒 凱

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理系，雅安 625014）

使用幾丁質(zhì)平板法篩選具有幾丁質(zhì)酶活性的微生物時，因幾丁質(zhì)平板本身為乳白趨于透明色，而降解環(huán)也為透明色，不易觀察到明顯的抑菌圈，故不易篩選出幾丁質(zhì)降解菌，而且其準(zhǔn)確性往往受到研究人員的影響，不同觀察者可能得出不同的結(jié)論。

1977年，Hankin和Anagnostakis首次發(fā)現(xiàn)，生長在含有纖維素剛果紅的瓊脂培養(yǎng)基上的纖維素降解菌的菌落周圍可產(chǎn)生降解環(huán)［1］。剛果紅是一種染料，它可以與多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不和降解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。根據(jù)此原理，當(dāng)在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅－纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。纖維素剛果紅培養(yǎng)基用于快速識別產(chǎn)纖維素酶菌株和初步判定酶活性高低，即產(chǎn)酶愈多，降解環(huán)愈大，產(chǎn)酶越快，降解環(huán)出現(xiàn)越早［2］。

幾丁質(zhì)可視為纖維素的類似物，它是通過β－1，4－糖苷鍵連接而成的不分支的2－乙酰氨基－2－脫氧－D－葡萄吡喃糖苷（N－乙酰氨基葡萄糖）的同聚物，相當(dāng)于纖維素C－2位置上的羥基被乙酸氨基所置換。因此，作者推測它也能替代纖維素而與剛果紅形成紅色復(fù)合物，故可使用含剛果紅的幾丁質(zhì)培養(yǎng)基來鑒別具有幾丁質(zhì)酶活性的菌株。該方法可能彌補(bǔ)通常采用的幾丁質(zhì)平板法鑒定含幾丁質(zhì)酶活微生物的缺點(diǎn)，有助于在微生物的分離中準(zhǔn)確地檢測到含有幾丁質(zhì)酶活性的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：由本實(shí)驗(yàn)室分離出具有幾丁質(zhì)酶活性的4株芽胞桿菌菌株，分別為Bacillus514、Bacillus132、Bacillus233、Bacillus515。

幾丁質(zhì)剛果紅培養(yǎng)基（根據(jù)纖維素剛果紅培養(yǎng)基改良）：硫酸銨0.2%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，氯化鈉0.05%，膠體幾丁質(zhì)3%，剛果紅0.2%，瓊脂1.5%～2%，p H7.0～7.2［3］。

幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：硫酸銨0.2%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，氯化鈉0.05%，膠體幾丁質(zhì)3%，瓊脂1.5%～2%，p H7.0～7.2。

液體培養(yǎng)基：牛肉膏1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，p H7.2。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂1.5%～2%，p H7.2。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，膠體幾丁質(zhì)3%，氯化鈉0.05%，磷酸鈉0.2%，酵母膏1.0%。

剛果紅0.1%染液：剛果紅0.1%。（0.1 g剛果紅溶于100 ML蒸餾水中）。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化

將具有幾丁質(zhì)酶活性的菌株接種于NA斜面上活化。

1.2.2 菌株接種及降解環(huán)的觀測

方法1：用接種環(huán)分別挑取4株少量菌體接種于幾丁質(zhì)培養(yǎng)基中央，32℃培養(yǎng)，每24 h取3皿用0.1%的剛果紅染色，染色1 h后用蒸餾水沖洗干凈，直到?jīng)]有浮色為止，觀測菌落周圍的降解環(huán)，直至降解環(huán)不再擴(kuò)大。

方法2：用接種環(huán)挑取少量菌體接種于含剛果紅的幾丁質(zhì)培養(yǎng)基中央，32℃培養(yǎng)，每24 h取3皿觀測1次，直至降解環(huán)不再擴(kuò)大。

1.2.3 幾丁質(zhì)酶粗酶液的提取

在250 ML三角瓶內(nèi)加入30 ML液體培養(yǎng)基，接一環(huán)菌種后于250 r／min、32℃搖床培養(yǎng)24 h，然后在250 ML三角瓶中加入25 ML產(chǎn)酶培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d后4 000 r／min離心20 min，上清液即為粗酶液，測定酶活性。

1.2.4 幾丁質(zhì)酶活力測定

按Joshi［4］方法進(jìn)行。取0.6 ML粗酶液加到1.0 ML含1% 膠體幾丁質(zhì)的磷酸緩沖液（p H6.6）中，45℃保溫30 min，加入1.5 ML 3，5－二硝基水楊酸試劑終止反應(yīng)，并加熱100℃，10 min，冰浴冷卻，離心后取上清液在波長530 nm下測吸光度，計算產(chǎn)生的N－乙酰氨基葡萄糖（NAG）的量。

酶活單位定義：在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol N－乙酰氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量，定義為一個酶活力單位（U）。

1.2.5 統(tǒng)計方法

試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過Excel 2003軟件進(jìn)行初步統(tǒng)計，幾丁質(zhì)平板中的降解環(huán)大小隨時間的變化函數(shù)關(guān)系采用SPSS16.0中Nonlinear的對數(shù)曲線進(jìn)行擬合。以p＜0.05和p＜0.01分別示差異的顯著和極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 使用方法1對幾丁質(zhì)平板染色后觀測到的降解環(huán)

如圖1所示，圖a、b、c分別是用方法1接種Bacillus515于幾丁質(zhì)平板，對其染色后形成的3個重復(fù)，形成的降解環(huán)直徑大小差異不大，分別為3.6、3.7 cm和3.7 cm。圖1d為未用0.1%的剛果紅染液染色的幾丁質(zhì)平板，可以看出在菌落周圍有一圈透明的降解環(huán)，但邊界不清晰，極不易觀察。圖1e為用方法1染色的未接種平板，整個平板是均一的紅色，未觀察到有透明圈出現(xiàn)。

2.2 使用方法2在幾丁質(zhì)平板上觀測到的降解環(huán)

如圖2所示，圖a、b、c分別是用方法2接種Bacillus515于幾丁質(zhì)平板，對其染色后形成的3個重復(fù)，形成的降解環(huán)直徑大小差異不大，分別為3.6、3.8 cm和3.7 cm。圖2e為用方法2染色的未接種的平板，整個平板是均一的紅色，未觀察到有透明圈出現(xiàn)。

圖1 使用方法1染色形成的降解環(huán)

圖2 使用方法2染色形成的降解環(huán)

2.3 降解環(huán)直徑大小與培養(yǎng)時間的關(guān)系

由圖3和圖4可以看出，降解環(huán)的直徑大小隨著時間的增加符合微生物的對數(shù)生長規(guī)律，方法1的R2達(dá)到了0.952 2，方法2的R2達(dá)到了0.959 8，由此可以推測出，在對數(shù)生長期，營養(yǎng)充足，Bacillus515的生長速率快、代謝旺盛、酶系活躍、活細(xì)菌數(shù)和總細(xì)菌數(shù)大致接近、細(xì)胞的化學(xué)組成形態(tài)理化性質(zhì)基本一致，隨著細(xì)菌數(shù)量的增長，降解幾丁質(zhì)的物質(zhì)的分泌也就越多，在42 h內(nèi)細(xì)菌的增長速度較快，降解環(huán)迅速擴(kuò)大，第3天后細(xì)菌分泌物的分泌變慢，降解環(huán)緩慢擴(kuò)大，到了第7天，細(xì)菌分泌物達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)，降解環(huán)的大小也就處于穩(wěn)定狀態(tài)。

圖3 使用方法1在不同時間形成的降解環(huán)直徑

在方法1和方法2的比較中，方法1在第6天產(chǎn)生的降解環(huán)直徑就達(dá)到了最大，而方法2在第7天產(chǎn)生的降解環(huán)直徑達(dá)到最大，兩者降解環(huán)達(dá)到最大直徑的時間基本一致。

圖4 使用方法2在不同時間形成的降解環(huán)直徑

2.4 幾丁質(zhì)酶活性與降解環(huán)大小的關(guān)系

使用SPSS16.0軟件對幾丁質(zhì)酶活性和降解環(huán)直徑之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，其中，在p＝0.010的條件下，其R＝0.990，即相關(guān)性顯著，故降解環(huán)的大小可反映酶活大小（表1）。

表1 菌株的幾丁質(zhì)酶活性及降解環(huán)大小

3 結(jié)論與討論

直接利用微生物防治植物病害是傳統(tǒng)生物防治的主要途徑，其中幾丁質(zhì)酶的利用是生防的一個重要方向。對植物具有致病能力的真菌的細(xì)胞壁是由幾丁質(zhì)組成的，而具有幾丁質(zhì)酶活性的微生物通過降解真菌細(xì)胞壁從而起到防治真菌病害的作用。幾丁質(zhì)酶作為一種具有生物活性的物質(zhì)，不僅可以用來抗真菌，同時對線蟲、昆蟲也具有一定的抗性［5］。因此，快速、有效地篩選具有幾丁質(zhì)酶活性的菌株具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文所開發(fā)的2種染色方法，具有可重復(fù)性，且2種方法形成的降解環(huán)的差異不大。在幾丁質(zhì)平板接種后第7天觀測到菌株的分泌物形成降解環(huán)達(dá)到最大，與芽胞桿菌生長的對數(shù)曲線相一致，推測分泌出的分解幾丁質(zhì)的物質(zhì)已不再增多，故第7天為最佳觀測時期。2種方法對幾丁質(zhì)平板染色后觀測到的降解環(huán)為淺紅色，未降解部分為深紅色，因此容易準(zhǔn)確地觀察；而未染色的幾丁質(zhì)平板整個平面呈乳白色，且降解環(huán)為透明色，因顏色相近而不易觀測。因此，剛果紅染色后的幾丁質(zhì)平板比未染色的平板能更好、更直觀、更準(zhǔn)確地觀測到降解環(huán)。但在試驗(yàn)過程中，使用方法1也有不足，用蒸餾水沖去浮色時，易沖去菌苔而觀察不全菌落形態(tài)，且不能繼續(xù)培養(yǎng)菌株（因打開培養(yǎng)皿蓋子而易受污染）來觀察降解環(huán)的動態(tài)變化，而使用方法2不僅能清晰地觀測到降解環(huán)，并能觀察菌落的動態(tài)生長情況，因此使用方法2更為科學(xué)、準(zhǔn)確。

根據(jù) Wood的研究［6－8］，推測形成淺紅色的降解環(huán)的原因可能是：多糖類物質(zhì)水解后形成大量含有β－1，4－D吡喃型葡萄糖、β－1，3－D葡聚糖及乳糖－葡甘露糖聚合糖等結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，與剛果紅染料結(jié)合形成大量的紅色多聚糖－剛果紅復(fù)合物，幾丁質(zhì)是2－氨基－2－脫氧－β－D－葡萄糖單元的共聚體，水解后與剛果紅染料形成紅色物質(zhì)，而用具有幾丁質(zhì)酶活性的細(xì)菌降解幾丁質(zhì)后形成了葡萄糖，不能與剛果紅染料形成紅色物質(zhì)，故在深紅色的平板上形成了淺紅色的降解環(huán)。

本試驗(yàn)證明被篩選菌的幾丁質(zhì)酶活性越強(qiáng)，幾丁質(zhì)剛果紅平板的降解環(huán)也越大。因此，可以根據(jù)幾丁質(zhì)平板上降解環(huán)的大小來推測菌株的幾丁質(zhì)酶活性的大小，進(jìn)而篩選出幾丁質(zhì)酶活性較強(qiáng)的菌株，這也為菌株的誘變改良提供了直觀、準(zhǔn)確的篩選方法，可通過此方法快速篩選出具有幾丁質(zhì)酶活性的細(xì)菌菌株。

這兩種染色方法彌補(bǔ)了通常采用的幾丁質(zhì)平板法鑒定含幾丁質(zhì)酶活性芽胞桿菌的缺點(diǎn)，在芽胞桿菌的分離中能快速、有效地檢測到幾丁質(zhì)酶活性菌株，為篩選具有幾丁質(zhì)酶活性的芽胞桿菌提供了新方法，但能否用于檢測其他微生物幾丁質(zhì)酶活性還有待進(jìn)一步證實(shí)。

［1］Hankin L，Anagnostakis S L.Solid mediuMcontaining carboxy methylcellulose to detect Cx cellulase activity of micro－organisms［J］.Gen Microbiology，1977，98：109－105.

［2］劉起麗，張建新，徐瑞富.纖維素剛果紅培養(yǎng)基篩選產(chǎn)纖維素酶菌株的影響因素研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，16（5）：279－283.

［3］張宇昊，王頡，張偉，等.一種改進(jìn)的纖維素分解菌鑒別培養(yǎng)基［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2004，1（12）：33－36.

［4］Joshi S，Kozlowshi M，Rishens S，et al.Chitinase and chitobiase production during fermentation of genetically improvedSerratialiquefaciens［J］.Enzyme Microb Technol，1989，11（5）：289－296.

［5］韓寶芹，余長纓，劉萬順，等.幾丁質(zhì)酶研究現(xiàn)狀及展望［J］.中國海洋藥物雜志，2001（5）：41－43.

［6］Wood P J，F(xiàn)ulcher R G.Interaction of some dyes with cereal β－glucans［J］.Cereal Chem，1978，55：952－966.

［7］Wood P J.The interaction of direct dyes with water soluble substituted cellulose and cerealβ－glucans［J］.Ind Eng CheMProd Res Dev，1980，19：19－23.

［8］Wood P J.Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides［J］.Carbohydr Res，1980，85：271－287.