新病害—山核桃果實(shí)黑斑病病原菌的鑒定

張傳清， 徐志宏＊， 孫品雷， 陳為民， 徐炳潮， 俞春來(lái)， 包春泉

（1.浙江林學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院植物保護(hù)系，臨安 311300； 2.浙江省杭州市森林病蟲(chóng)防治站，310009；3.浙江省臨安市森林病蟲(chóng)防治站，311300； 4.浙江省淳安縣森林病蟲(chóng)防治站，311700；5.浙江省桐廬縣森林病蟲(chóng)防治站，311500）

胡桃科（Juglandaceae）山核桃屬（Carya）植物是著名的干果樹(shù)種，浙江山核桃（C.cathayensis）具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，發(fā)展前景廣闊。隨著人民生活水平的提高，山核桃越來(lái)越受到人們的重視，產(chǎn)品供不應(yīng)求，僅浙江臨安的栽培面積就超過(guò)2.5萬(wàn)hm2。2007年，浙江杭州地區(qū)（臨安、淳安和桐廬市）、安徽寧國(guó)等地山核桃的果實(shí)出現(xiàn)了一種新的病害—果實(shí)黑斑病，農(nóng)戶形象地稱之為山核桃“黑籽病”或“花籽病”。該病害于幼果期開(kāi)始表現(xiàn)癥狀，起初在幼果上形成小黑點(diǎn)，發(fā)展成直徑1～2 cm左右的近圓形稍凹陷的黑斑，后病斑不斷擴(kuò)大連接成大片不規(guī)則形狀的黑斑。至山核桃成熟時(shí)除了在果皮上形成大片黑斑外，還會(huì)導(dǎo)致內(nèi)部果肉發(fā)黑，口感苦澀，嚴(yán)重影響山核桃的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前該病害有逐年加重的趨勢(shì)，2008年浙江臨安、淳安和桐廬等山核桃主產(chǎn)區(qū)的平均病果率達(dá)5%，嚴(yán)重的地區(qū)超過(guò)20%。但還沒(méi)有該病害病原物的相關(guān)報(bào)道，類似病害在胡桃科作物上也未見(jiàn)報(bào)道，由此導(dǎo)致對(duì)該病害的防治十分盲目，無(wú)法采取針對(duì)性的措施。因此，作者于2008年從不同地區(qū)采集山核桃病果，進(jìn)行了病原菌分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離、純化與培養(yǎng)

2008年6－8月從不同地區(qū)采集具有典型癥狀的病果（圖1），帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)組織分離。分離物采用常規(guī)方法進(jìn)行單孢純化，純化獲得的菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其培養(yǎng)特征，7 d后用無(wú)菌水洗下孢子，顯微觀察其形態(tài)特征。

1.2 分離物的回接與再分離

采用離體幼果接種法。從無(wú)該病發(fā)生的地區(qū)采集健康的山核桃幼果，將其放置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，底部用含無(wú)菌水的濾紙保濕。隨機(jī)選取HT－3、HT－38和HT－16等10個(gè)菌株，在PDA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7 d后用含0.01%吐溫－80的無(wú)菌水洗下孢子并調(diào)節(jié)濃度至106個(gè)／ML，用喉頭噴霧器將上述分生孢子懸浮液噴在山核桃幼果表面。以含0.01%吐溫－80的無(wú)菌水為對(duì)照（CK）。每個(gè)菌株3次重復(fù)，每次重復(fù)接種2顆果實(shí)。接種后的果實(shí)放在25℃，L∥D＝12 h∥12 h，85%RH條件下培養(yǎng)。果實(shí)發(fā)病后進(jìn)行病原菌的再分離。

1.3 r DNA ITS擴(kuò)增所用引物

采用擴(kuò)增真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的通用引物［1］，由上海生工合成。上游引物ITS1（5′－TCCGTAGTGAACCTGCGG－3′），下游引物ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）。

1.4 DNA提取

各菌株在PDA培養(yǎng)基上于25℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，用滅菌載玻片刮取菌絲。DNA提取采用UNIQ－10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）。

1.5 ITS的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃保溫10 min［1］。DNA序列測(cè)定委托上海英駿有限公司進(jìn)行。測(cè)得的序列通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)。

圖1 山核桃果實(shí)黑斑病的田間癥狀

2 結(jié)果與分析

2.1 分離物的培養(yǎng)和形態(tài)特征

從不同地區(qū)不同時(shí)間采集的病果都分離得到了同一種真菌，該菌在PDA培養(yǎng)基上形成白色菌落，具明顯的同心輪紋。分生孢子盤(pán)球形，直徑108～220μm。分生孢子長(zhǎng)梭形，直或彎曲，（22.6～29.9）μm×（6.1～9.0）μm，5個(gè)細(xì)胞、中間3個(gè)有色孢（上部2個(gè)為黑褐色、下部1個(gè)為淡橄欖色），孢子頂生2～3根附屬絲、多為3根，15.8～33.6μm，附屬絲末端無(wú)匙狀膨大（圖2）。根據(jù)上述培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征將其初步鑒定為小孢擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsismicrospora）。

圖2 山核桃果實(shí)黑斑病病原菌的分生孢子形態(tài)

2.2 分離物的致病性

HT－3、HT－38和 HT－16等隨機(jī)選擇的10個(gè)菌株通過(guò)離體幼果接種7 d后都出現(xiàn)了明顯的癥狀：果面上形成不規(guī)則形狀的黑斑（圖3）。該癥狀與田間病果一致，而對(duì)照果實(shí)保持健康，沒(méi)有出現(xiàn)任何癥狀。

圖3 山核桃果實(shí)黑斑病病原菌的人工接種結(jié)果

2.3 病原菌的ITS序列

HT－3、HT－38和 HT－16等10個(gè)菌株經(jīng)PCR后都獲得500 bp左右的片段，測(cè)序結(jié)果表明供試的菌株間序列完全一致。本病原菌的ITS序列（GenBank登錄號(hào)：FJ947050）與小孢擬盤(pán)多毛孢（P.microspora）多個(gè)菌株（GenBank登錄號(hào)：FJ459951.1，F(xiàn)J459950.1，F(xiàn)J459949.1和EU279435.1）的序列一致性達(dá)100%。

綜合上述培養(yǎng)性狀和分生孢子的形態(tài)特征，將引起山核桃果實(shí)黑斑病的病原菌鑒定為小孢擬盤(pán)多毛孢（P.microspora）。

3 討論

前人研究認(rèn)為分生孢子中間色胞顏色類型即淡色（褐色至橄欖色）和暗色（暗褐色或煤煙色至褐色）是擬盤(pán)多毛孢屬首要的分類特征，分生孢子頂端附屬絲末端匙狀膨大與否是第二重要的分類特征，此外分生孢子的長(zhǎng)度和寬度等也是重要的分類特征［2－3］。韋繼光等提出單純依賴形態(tài)特征鑒定擬盤(pán)多毛孢的種類會(huì)存在較大的誤差，而應(yīng)該綜合形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)特征進(jìn)行界定［4］。

本研究于不同時(shí)間從采自不同地區(qū)山核桃果實(shí)黑斑病病果上都分離出了同一種優(yōu)勢(shì)的真菌，其在接種時(shí)能引起與自然發(fā)病相同的癥狀，說(shuō)明本研究獲得的分離物是山核桃果實(shí)黑斑病的病原菌。該真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)特征和Pestalotiopsis一致。本研究在綜合病原物的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和ITS序列后認(rèn)為，山核桃果實(shí)黑斑病的病原為小孢擬盤(pán)多毛孢（P.microspora）。雖然從病果上也分離到了少量葡萄座腔菌屬和鏈格孢屬2種真菌，但它們?cè)诮臃N時(shí)都不能引起健康的山核桃果實(shí)發(fā)病。目前還未見(jiàn)其他山核桃屬植物上有關(guān)Pestalotiopsis引起果實(shí)病害的報(bào)道。下一步需要對(duì)病害循環(huán)和防治措施進(jìn)行針對(duì)性的研究，以解決生產(chǎn)上盲目防治的問(wèn)題。

［1］張劍.小孢擬盤(pán)多毛孢的鑒定與除草活性物質(zhì)分析［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［2］Guba E F.Monograph ofMonochaetiaandPestalotia［M］.Massachusetts：Harvard University Press，1961.

［3］劉愛(ài)榮.海南植物內(nèi)生擬盤(pán)多毛孢的多樣性及擬盤(pán)多毛孢屬分子系統(tǒng)學(xué)研究 ［D］.杭州：浙江大學(xué)，2006.

［4］韋繼光，徐同，郭良棟，等.根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)特征界定擬盤(pán)多毛孢屬的種［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2005，24（4）：304－313.