甘肅省南瓜及西葫蘆小西葫蘆黃花葉病毒病鑒定

文朝慧， 劉雅莉

（甘肅出入境檢驗檢疫局，蘭州 730020）

小西葫蘆黃花葉病毒［Zucchiniyellowmosaic virus（ZYMV）］屬馬鈴薯Y病毒屬成員，病毒粒子為彎曲線狀，長750nm，直徑11nm，含一條單鏈正義RNA。該病毒1973年首次分離于意大利［1］，主要通過蚜蟲以非持久性方式高效傳播［2］，能侵染葫蘆科、豆科、莧科、藜科等11科植物［3］，目前在澳大利亞、法國、德國、西班牙、英國、美國、日本等廣泛發生，是世界性分布和危害最嚴重的病毒之一。被小西葫蘆黃花葉病毒侵染的葫蘆科作物，葉片黃化并帶有嚴重花葉、畸形，產量大幅度降低［4］。據Tóbiás［5］、Schrijnwerkers［6］等研究，ZYMV 可通過南瓜和筍瓜的種子進行傳播。

甘肅省河西地區氣候干燥，光照充足，晝夜溫差大，綠洲與戈壁交錯形成天然的隔離條件，病蟲危害輕，是各類農作物制種的理想基地，目前該地區已發展為我國重要的對境外制種基地，其對外繁種的瓜類作物有西瓜、甜瓜、黃瓜、冬瓜、苦瓜、西葫蘆、南瓜、瓠瓜、角瓜等多種。這些作物原種來自國外，繁育收獲后的種子出口到美國、德國、荷蘭、以色列、日本、韓國、我國臺灣等30個國家或地區，因而每年出入境的南瓜、西葫蘆等作物種子眾多。近年來，河西地區瓜類作物病毒病害發生嚴重，田間發病率可達15%，但病原不清，為明確ZYMV在當地瓜類作物上的危害情況，作者對該地區南瓜［Cucurbitamoschata（Duch.）Poiret］和西葫蘆（C.pepoLinn.）的田間病樣和出入境種子含帶小西葫蘆黃花葉病毒情況進行了系統調查和鑒定，利用植物病毒的抗血清對全部樣本進行了ELISA檢測，對ELISA部分陽性樣本進行了RT－PCR擴增、測序及序列分析。

1 材料和方法

1.1 病害調查和樣本采集

1）2006－2008年每年7月，在甘肅省河西地區采集可能被病毒感染、癥狀明顯的南瓜、西葫蘆葉片及果實，分別裝在不同的潔凈塑料袋中，標明采集時間、地點和材料，保存于－70℃低溫冰箱。

2）供試種子58份，為本實驗室檢測的河西地區出入境種子，檢測樣本為隨機抽取材料。

1.2 主要試劑

ZYMV酶聯免疫吸附檢測試劑盒購自美國Agdia公司；Trizol購自Invitrogen公司；M－MLV反轉錄酶、RNase抑制劑、TaqDNA 聚合酶、dNTP、100bp ladder DNA marker購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工生物技術有限公司；其他化學試劑為國產分析純。

1.3 DAS－ELISA檢測

采用堿性磷酸酯酶標記雙抗體夾心法（DASELISA）對全部樣本進行血清學檢測，具體檢測步驟參照提供抗體的公司產品說明書。以健康植株／種子為陰性對照，樣品A值／陰性對照A值大于2為陽性反應，A值利用 MUTISKAN型Thermo labsystems酶標儀在405nm波長下測定。

1.4 RT－PCR擴增和測序分析

1.4.1 引物合成

根據GenBank已報道的ZYMV病毒基因組保守序列，設計并合成寡核苷酸引物。p1：5′－ATGCAGAGGCACCATACAT－3′；p2：5′－TACTGCATTGTGTTCACACC－3′［7］。預 期 擴 增 產 物 大 小 為283bp。

1.4.2 植物組織總RNA的提取

1）田間病樣以Trizol法提取。稱取0.1g植物葉片倒在潔凈的研缽內，加液氮研細，移入1.5mL離心管中（DEPC處理），加入1mL的Trizol，劇烈振蕩3min以上；4℃下，12 000r／min離心10min以除去不溶成分，將上清轉入另一新的1.5mL離心管中；加0.2mL氯仿，振蕩混勻15min，然后在室溫下靜置2～15min，再于4℃、12 000r／min離心15min；將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中，加0.5mL異丙醇，上下顛倒混勻；室溫靜置15min；4℃、12 000r／min離心10min，棄上清，加入75%乙醇洗滌沉淀，然后4℃、7 500r／min離心5min，棄乙醇；室溫晾干5～10min，加入30μL DEPC處理的超純水溶解，－70℃保存備用。

2）種子樣本以SDS－酚氯仿法提取［8］。稱取2.5g種子放入預冷的研缽內，加液氮研磨成粉末狀，將粉末轉入15mL預冷的離心管中，加入6mL RNA抽提緩沖液（50mmol／L Tris－HCl，pH 8.0；10mmol／L EDTA，pH 8.0；140mmol／L NaCl；1%SDS；2%PVP）及等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），振蕩均勻，冰浴10min；4℃、12 000r／min離心15min；取上清液，加等體積氯仿：異戊醇（24∶1）、1／4體積無水乙醇、1／10體積5mol／L乙酸鉀，振蕩均勻，冰浴10min；4℃、12 000r／min離心15min；將上層水相轉移到新的1.5mL離心管中，以異丙醇沉淀RNA，其余步驟同1）。

1.4.3 RT－PCR反應

cDNA第1鏈的合成：以1μL總RNA為模板，加入1μL dNTP（10mmol／L）、10μL DEPC 水、2μL p2，70℃保溫5min后，冰上放置2min，再加入4μL 5×反轉錄buffer、1μL RNAsin（40U／μL）、1μL M－MLV（200U／μL），37℃反應40min。

PCR：以合成的cDNA第1鏈為模板進行PCR擴增。擴增條件為：94℃預變性10min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環，最后一輪循環后在72℃延伸10min。取10μL PCR產物經1.0%瓊脂糖電泳，凝膠成像儀分析并記錄結果。

1.4.4 序列測定和序列相似性比較

RT－PCR產物用UNIQ－10柱式PCR純化試劑盒（Sangon）純化后，直接用于測序，序列測定在ABI 3730XL DNA測序儀上完成（委托TaKaRa公司進行）。測序結果通過BLASTn與GenBank中目標核苷酸序列進行相似性比較。

2 結果與分析

2.1 南瓜和西葫蘆ZYMV病毒病的癥狀

在田間病害調查中發現，瓜類作物受病毒病侵染后，常常表現為系統花葉，病葉出現斑駁、皰斑、皺縮（封面a），病果實表面斑駁、有瘤狀突起、果形扭曲等（封面b），僅根據田間癥狀難以確定所感染的病毒種類。

結合實驗室檢測結果發現，受ZYMV侵害后，發病初期西葫蘆葉片出現局部褪綠斑、明脈，后表現葉片花葉，新葉上有皰斑甚至發生嚴重的蕨葉現象（封面c），而南瓜病葉的癥狀與西葫蘆的相似。

2.2 DAS－ELISA檢測結果

在南瓜和西葫蘆田間病樣中均檢測出ZYMV，其中10個南瓜顯癥葉片樣本中有5個感染ZYMV，9個西葫蘆顯癥葉片樣本中有3個感染ZYMV。在24份南瓜種子中有3份檢出ZYMV，分別為來自我國臺灣、荷蘭和以色列，種子帶毒批次占12.5%；在34份西葫蘆種子中有4份檢出ZYMV，其中3份占從美國、韓國、哥斯達黎加進境的種子，1份為出境的種子，種子帶毒批次占11.8%。

2.3 RT－PCR擴增及序列分析

RT－PCR擴增結束后，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖1），ZYMV陽性樣品擴增出約280bp的條帶，片段大小與預期結果一致，且無非特異性片段的產生；陰性對照和空白對照均未出現相應條帶。

經序列測定和序列相似性比較，該擴增產物核苷酸序列與世界各地的ZYMV分離物CP基因相似性大于93%，證明該DNA片段為ZYMV的部分序列。

圖1 RT－PCR擴增結果

3 討論

小西葫蘆黃花葉病毒自1991年在國內首次報道發生以來［9］，在河南、陜西、河北、山西、北京、廣州、浙江杭州和廣西等地的葫蘆科作物上相繼發現危害，已成為我國葫蘆科作物的主要病原［10］。目前ZYMV雖然不屬于檢疫對象，但其在多個國家和地區發生流行，危害嚴重，2006－2008年筆者已數次在出入境種子中檢測到該病毒，ZYMV在甘肅河西地區除侵染南瓜和西葫蘆外，也危害黃瓜、西瓜和甜瓜等其他瓜類作物（待發表）。在調查和檢測中發現，河西地區瓜類作物病毒病的病原還有黃瓜花葉病毒（CMV）和黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV），從檢出頻率看ZYMV是侵染甘肅瓜類作物的重要病毒種類。

Heather對ZYMV的進化研究表明，人為傳播在ZYMV的世界性傳播蔓延中起重要作用［11］。Fletcher的田間試驗表明，作物早期及中期感染ZYMV將造成產量的嚴重損失［12］。在作者的檢測中，西葫蘆種子帶毒批次占11.8%，南瓜種子帶毒批次占12.5%，證實ZYMV可隨南瓜和西葫蘆帶毒種子的調運而傳播蔓延，如果播種帶病種子，長出的幼苗發病后，就形成田間初侵染源，加之河西地區夏季高溫干旱，蚜蟲發生量大，很容易造成瓜類作物病毒病的發生流行，因此加強種子檢疫、種植無毒種子是防治該病毒病的重要措施。

ZYMV的常規檢測手段包括生物學檢測、電鏡觀察及免疫學方法等，分子檢測技術大多以感染ZYMV的植株葉片為檢測材料，筆者除檢測田間顯示癥狀的葉片外，還直接對西葫蘆和南瓜干種子進行了檢測。鑒于種子帶毒的不均勻性，在用RTPCR方法檢測種子中的ZYMV時，對一份樣品需要設置多個重復，以提高診斷結果的準確性。本研究采用DAS－ELISA和RT－PCR相結合的方法，鑒定了引起甘肅河西地區南瓜及西葫蘆病毒病的小西葫蘆黃花葉病毒，分析了田間發生和種子帶毒情況，建立了切實有效的檢測體系與方法，為該病害的防控提供了科學依據。

［1］Lisa V，Boccardo G，D’Agostino G，et al.Characterization of apotyvirus that causes zucchini yellow mosaic［J］.Phytopathology，1981，71：667－672.

［2］趙榮樂，鄭光宇.桃蚜可高效率地傳播小西葫蘆黃化花葉病毒新疆株［J］.北京師范大學學報（自然科學版），2003，39（3）：98－101.

［3］陳潔云，陳集雙，柴立紅，等.侵染南瓜的小西葫蘆黃化花葉病毒的分離與鑒定［J］.浙江大學學報（農業與生命科學版），2003，29（5）：539－544.

［4］陳潔云，陳集雙，柴立紅，等.兩種葫蘆科病毒的分子檢測和致病性研究［J］.植物病理學報，2003，33（5）：449－455.

［5］Tóbiás I，SzabóB，Salánki K，et al.Seedborne transmission ofZucchiniyellowmosaicvirusandCucumbermosaicvirusin Styrian Hulless group ofCucurbitapepo［C］∥Cucurbitaceae 2008，Proceedings of the IXth EUCARPIA meeting on genetics and breeding of Cucurbitaceae，Avignon（France），May 21－24th，2008：189－198.

［6］Schrijnwerkers C C F M，Huijberts N，Bos L.Zucchiniyellow mosaicvirus：two outbreaks in the Netherlands and seed transmissibility［J］.Eur J Plant Pathol 97，1991：187－191.

［7］張永江.一步法RT－PCR檢測小西葫蘆黃花葉病毒［J］.植物檢疫，2005，19（3）：141－142.

［8］王杰，王曉鳴，黃麗麗.大豆干種子中大豆花葉病毒的RT－PCR檢測［J］.植物病理學報，2005，35（3）：214－220.

［9］鄭光宇，董濤.在新疆發生的小西葫蘆黃化花葉病毒研究初報［J］.植物病理學報，1991，21（1）：72.

［10］古勤生，Piero Roggero，Marina Ciuffo，et al.我國北方地區葫蘆科作物病毒病的調查與病原鑒定［J］.云南農業大學學報，2003，18（4）：88－89.

［11］Heather E S，Edward C H，Andrew G S.Rapid evolutionary dynamics ofZucchiniyellowmosaicvirus［J］.J Gen Virol，2008，89：1081－1085.

［12］Fletcher J D，Wallace A R.Potyviruses in New Zealand buttercup squash （CucurbitamaximaDuch.）：yield and quality effects of ZYMV and WMV 2virus infections［J］.New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，2000，28（1）：17－26.