黑龍江省馬鈴薯干腐病菌種類鑒定及致病性

閔凡祥， 王曉丹， 胡林雙 魏 琪， 董學(xué)志李鳳蘭， 李鶴春， 劉偉婷， 郭 梅＊

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院脫毒苗木所，哈爾濱 150086； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030）

我國(guó)是馬鈴薯種植面積最大的國(guó)家［1］。隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，馬鈴薯的各種病害日趨嚴(yán)重，成為限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。其中馬鈴薯干腐病是馬鈴薯貯藏期主要病害之一，據(jù)報(bào)道，因馬鈴薯鐮刀菌干腐病導(dǎo)致窖貯損失率高達(dá)60%［2］，該病已成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸問(wèn)題［3］。因此，研究馬鈴薯干腐病鐮刀菌的種類，做到有目的防治，具重要的意義。本試驗(yàn)將采自黑龍江省馬鈴薯主要產(chǎn)區(qū)的干腐病樣品進(jìn)行了病原菌分離和純化，根據(jù)病原菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀對(duì)其進(jìn)行種類鑒定，并對(duì)不同種類鐮刀菌的致病性進(jìn)行比較，從而初步了解黑龍江省馬鈴薯主要產(chǎn)區(qū)鐮刀菌種類、分布及不同種鐮刀菌的致病性，為馬鈴薯干腐病有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種

對(duì)2005－2008年采集于哈爾濱、加格達(dá)奇、鶴崗、牡丹江、訥河、寧安、嫩江、克山、巴彥等100份樣品進(jìn)行病原菌分離純化，得到27個(gè)鐮刀菌菌株。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA），水瓊脂（WA），米飯培養(yǎng)基，Joffe修改的 Bilai’s培養(yǎng)基［4］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分離純化方法

采用常規(guī)真菌分離純化技術(shù)［5］。

1.2.2 病原菌致病性測(cè)定

選易感病的馬鈴薯‘Favorita’作為供試品種，試驗(yàn)設(shè)4次重復(fù)，每次重復(fù)選5個(gè)塊莖，以不接菌的5個(gè)塊莖為對(duì)照，用直徑0.5cm打孔器在經(jīng)75%乙醇表面消毒的健康馬鈴薯塊莖上打3個(gè)小孔，將在PSA平板上培養(yǎng)4d的直徑為0.5cm病菌菌絲塊接種于孔中，再將原薯塊組織塞回并用透明膠帶封口，置于25℃暗培養(yǎng)，10d后調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)［6］。淘汰不發(fā)病菌株，將發(fā)病菌株進(jìn)行下一步種類鑒定。

馬鈴薯鐮刀菌干腐病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，薯塊無(wú)病斑；1級(jí)，病斑面積占薯塊的5%以下；2級(jí)，病斑面積占薯塊的6%～15%；3級(jí)，病斑面積占薯塊的16%～30%；4級(jí)，病斑面積占薯塊的31%～50%；5級(jí)，病斑面積占薯塊的50%以上［7］。

1.2.3 鑒定方法

根據(jù)測(cè)定菌株生長(zhǎng)速度（在pH5.6左右的PSA培養(yǎng)基上，24～25℃下，4d后測(cè)得的菌落直徑），菌絲形狀，菌落色澤（培養(yǎng)物色澤是指病原菌在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d后，取出置于室內(nèi)散射光下2周后記載色澤。PSA上：PSA基物表面色澤指試管斜面的顏色；基物色澤指培養(yǎng)基有無(wú)變色，即菌株有無(wú)分泌色素。米飯和Bilai’s上記載綜合顏色。色澤名稱依據(jù)《色譜》一書進(jìn)行判斷［8］），小型分生孢子、大型分生孢子的數(shù)量及形狀，產(chǎn)孢細(xì)胞，厚垣孢子的有無(wú)，子實(shí)體類型，菌核以及子囊殼的有無(wú)等，按Booth C［9］分類系統(tǒng)的描述、圖譜及檢索表進(jìn)行比對(duì)，并參考John［10］和王拱辰［4］有關(guān)鐮刀菌鑒定方法進(jìn)行對(duì)比鑒定，根據(jù)綜合性狀確定不同鐮刀菌種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 通過(guò)致病性鑒定篩選出不同地區(qū)馬鈴薯鐮刀菌菌株

將采自黑龍江省不同地區(qū)的病樣分離培養(yǎng)及單孢分離純化獲得27株鐮刀菌菌株，再通過(guò)馬鈴薯塊莖接種，調(diào)查薯塊病情指數(shù)，與自然病薯的癥狀進(jìn)行比較。18個(gè)菌株侵染均表現(xiàn)不同程度黑褐色凹陷斑塊，切開(kāi)薯塊，18℃下病組織呈黑色至黑褐色，5℃下病組織呈淡褐色。病薯通常進(jìn)一步發(fā)展形成空洞，并且空洞內(nèi)有白色菌絲。與自然發(fā)病馬鈴薯干腐病癥狀相同，從回接發(fā)病馬鈴薯塊莖中可分離得到原接種病菌。以下是發(fā)病菌株來(lái)源、采集時(shí)間及編號(hào)，如表1所示。

表1 不同鐮刀菌菌株來(lái)源、采集時(shí)間及編號(hào)

2.2 馬鈴薯干腐病菌種類鑒定

將以上得到的18個(gè)馬鈴薯鐮刀菌致病菌株依據(jù)其培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征綜合分析，鑒定結(jié)果為：F.sambucinum，F(xiàn).avenaceum，F(xiàn).trichothecioides，F(xiàn).solanivar.coeruleum，F(xiàn).solani，F(xiàn).sporotrioides。其中F.sporotrioides所占比例最高，為35.29%，F(xiàn).solanivar.coeruleum比例最小，為5.88%。如表2所示。

表2 鐮刀菌種類鑒定結(jié)果

圖1 接骨木鐮孢（Fusarium sambucinum）培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特性

圖2 茄病鐮孢藍(lán)色變種（F.solani var.coeruleum）培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特性

圖3 茄鐮孢（F.solani）培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特性

圖4 擬枝孢鐮孢（F.sporotrioides）培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特性

圖5 燕麥鐮孢（F.avenaceum）培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特性

圖6 擬絲孢鐮孢（F.trichothecioides）培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特性

2.3 黑龍江省不同馬鈴薯鐮刀菌的致病性鑒定

圖7 不同鐮刀菌引起馬鈴薯干腐病病情指數(shù)（p＜0.05）

由圖7可見(jiàn)，不同鐮刀菌在感病品種‘Favorita’病情指數(shù)各不相同，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示各菌株間致病力差異顯著，致病力由強(qiáng)到弱依次為F.sambucinum，F(xiàn).avenaceum，F(xiàn).trichothecioides，F(xiàn).solanivar.coeruleum，F(xiàn).solani，F(xiàn).sporotrioides。說(shuō)明6個(gè)菌株中，有3個(gè)菌株致病力較強(qiáng)，另外3個(gè)致病力中等。

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯干腐病是由鐮刀菌引起，據(jù)統(tǒng)計(jì)世界上引起馬鈴薯干腐病病原有10種［11－12］之多，不同國(guó)家或地區(qū)鐮刀菌的種類不同。國(guó)內(nèi)對(duì)這方面報(bào)道不多，1994年葉琪明［13］報(bào)道了浙江省馬鈴薯干腐病鐮刀菌9個(gè)種和變種，分別為茄鐮孢（F.solani）、茄病鐮孢藍(lán)色變種（F.solanivar.coeruleum）、串珠鐮孢（F.moniliforme）、串珠鐮孢中間變種（F.moniliformevar.intermedium）、串珠鐮孢浙江變種（F.moniliformevar.zhejiangense）、尖鐮孢（F.oxysporum）、擬枝孢鐮孢（F.sporotrioides）、擬絲孢鐮孢（F.trichothecioides）和芳香鐮孢（F.redolens）。其中，致病力較強(qiáng)的種類有茄鐮孢及其變種、串珠鐮孢及其變種和擬絲孢鐮孢；2004年何蘇琴［15］報(bào)道甘肅省定西地區(qū)馬鈴薯干腐病，通過(guò)種類鑒定為硫色鐮刀菌（F.sulphureumSchlechlendahl）；2007年陳彥云［16］報(bào)道寧夏西吉縣馬鈴薯干腐病主要病原為茄病鐮孢藍(lán)色變種（F.solanivar.coeruleum）和接骨木鐮孢（F.sambucinum）。2008年彭學(xué)文［14］報(bào)道河北省馬鈴薯干腐病主要由茄鐮孢（Fusariumsolani）和半裸鐮孢（F.semitectum）引起；黑龍江省是我國(guó)馬鈴薯主要產(chǎn)區(qū)之一，每年馬鈴薯干腐病均有不同程度發(fā)生，對(duì)其主要病原菌分類還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，本研究結(jié)果表明黑龍江省馬鈴薯干腐病主要病原有6個(gè)種和變種，分別為F.sambucinum，F(xiàn).avenaceum，F(xiàn).trichothecioides，F(xiàn).solanivar.coeruleum，F(xiàn).solani，F(xiàn).sporotrioides。其中，致病力較強(qiáng)的為F.sambucinum，F(xiàn).avenaceum和F.trichothecioides。燕麥鐮孢（F.avenaceum）作為馬鈴薯干腐病主要病原為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。黑龍江省是否有其他種類鐮刀菌，還需要繼續(xù)廣泛采集樣品，進(jìn)一步鑒定。

鐮刀菌在自然界中分布廣泛，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌分生孢子（特別是大分生孢子）、分生孢子座、產(chǎn)孢細(xì)胞形態(tài)及培養(yǎng)性狀等方面具有多樣性，易受環(huán)境影響產(chǎn)生變異，因此，鑒定和識(shí)別不同鐮刀菌種類比較復(fù)雜和困難，但隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，采用分子檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，可以快速、準(zhǔn)確鑒定鐮刀菌種類，將是鐮刀菌鑒定的發(fā)展方向，同時(shí)可進(jìn)一步完善我國(guó)馬鈴薯鐮刀菌檢測(cè)鑒定技術(shù)，為馬鈴薯干腐病防治奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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