安全劑AD－67保護玉米免受單嘧磺隆藥害的作用及其機理

葉 非， 付 穎＊， 徐偉鈞， 王 爽

（1.東北農業大學理學院，哈爾濱 150030； 2.黑龍江省農業科學研究院，哈爾濱 150086）

磺酰脲類除草劑是目前世界上最大的一類除草劑，它作用于植物體內的乙酰乳酸合成酶（ALS），通過植物的根、葉吸收，在植物體內雙向傳導。由于ALS被抑制，支鏈氨基酸的合成受到阻礙，細胞的分裂被抑制，從而導致雜草的正常生長受到破壞而死亡［1］。目前有關磺酰脲類除草劑的專利有400多項，已商品化的有30多種。這類除草劑具有很高的除草效果，用量為2～100g／hm2，比傳統除草劑的除草效果高100～1 000倍［2］。隨著磺酰脲類除草劑的開發和廣泛應用，一些品種對后茬作物的長殘留藥害問題以及除草劑殘留物引起的環境問題、雜草的抗藥性及藥害等問題亦引起了人們的重視［3］。單嘧磺?。∟－（2’－（4’－甲基）嘧啶基）2硝基苯磺酰脲）屬于磺酰脲類除草劑，是我國第一個具有自主知識產權的農藥品種，它主要用于防治小麥田里播娘蒿、薺菜、麥瓶草等雜草，尤其對華北地區的難治雜草堿茅防效很好［4－5］。單嘧磺隆與酰胺類或三嗪類除草劑適量混用，用于夏玉米苗后莖葉處理，對馬唐、稗草、反枝莧、藜、馬齒莧等玉米田常見雜草均可有效防除。范志金等研究表明：單嘧磺隆作用靶標是乙酰乳酸合成酶，對不同玉米品種ALS活性的影響存在差異［6］。但是，單嘧磺隆易受氣候和土壤因素的影響而不利于其降解，造成在土壤中殘留與蓄積，并對下茬敏感作物和蔬菜產生藥害。

除草劑安全劑又稱除草劑解毒劑或稱作物安全劑，它可以在不影響除草劑對靶標雜草活性的前提下有選擇地保護作物免遭除草劑的藥害，還可以用于初步解釋除草劑作用靶標和作用機制［7］。近年來，隨著生物化學領域分離、純化等技術的快速發展和提高，國內外學者不僅從安全劑對作物的吸收、傳導影響方面，而且從安全劑對作物體內谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽－S－轉移酶（GSTs）和及除草劑靶標酶的影響等方面進行了研究，以揭示安全劑作用的本質［8］。除草劑安全劑AD－67屬于二氯乙酰基噁唑烷類化合物，可使玉米免受硫代氨基甲酸酯類和酰胺類除草劑的藥害，增加GSH的含量，提高GST的活性［9］，但對單嘧磺隆保護玉米的作用，目前國內外尚無報道。作者通過生物測定方法測定了AD－67對玉米的保護作用，并對玉米體內除草劑靶標酶乙酰乳酸合成酶（ALS）的活性和GSH進行了研究，初步探討AD－67保護玉米免受單嘧磺隆藥害的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥劑：10%單嘧磺隆可濕性粉劑，南開大學元素有機所提供；安全劑AD－67，本課題組合成；TCA（三氯乙酸），北京順義永遂化工廠；DTNB（5，5－二硫代雙乙硝基甲酸）、TPP（硫胺素焦磷酸）、DTT（二硫代蘇糖酸醇）、谷胱甘肽（GSH），Sigma公司產品。

供試玉米品種：東農248，東北農業大學農學院提供。

試驗土壤：取自東北農業大學實驗田，1～15cm無污染的耕層土壤，過篩、自然風干后使用。土壤pH為7.37，有機質含量為2.37%。

1.2 方法

1.2.1 AD－67對單嘧磺隆解毒效果試驗

取定量過2mm篩的風干土，加入單嘧磺隆，配制成0、0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg的毒土，裝入小紙杯內，平衡12h。

將精選的玉米種子用50℃左右的溫水浸泡30min，12%的H2O2浸泡10min，用蒸餾水沖洗干凈，再用不同濃度的 AD－67溶液（0、0.5、1、5mg／kg和10mg／kg）浸種12h左右，用蒸餾水清洗干凈，放在培養箱內，26.5℃催芽24h左右（玉米芽長約1mm）。

選擇芽長一致的玉米種子8粒，均勻擺放在藥土表面，上覆藥土1cm左右，放置培養箱內培養（溫度26.5℃、濕度75%、光照與黑暗各12h循環培養），玉米生長6d后，測玉米幼苗的主根長、根鮮重、株高、株鮮重。各處理重復3次，數據采用SAS系統進行處理，進行方差分析。

1.2.2 GSH 含量的測定［10］

取玉米幼苗的葉片0.5g，加2.0mL 15%的TCA，在0～4℃下研磨，再加1.0mL 15%的TCA沖洗，放入離心管中離心（12 000r／min）20min，取1mL離心后的上清液放入試管，加2.0mL的磷酸緩沖 液 （0.5mol／L，pH ＝8），加 入 0.025mL 10mmol／L的DTNB顯色，在412nm下測定A值。

1.2.3 ALS的提取和活性測定［11］

ALS的提取：取玉米幼苗的根部1.0g，加入3.0mL ALS酶提取液（0.05mol／L，pH＝7.0磷酸鉀緩沖液，內含1mmol／L的丙酮酸鈉，0.5mmol／L MgCl2，0.5mmol／L的 TPP，10μmol／L的 FAD），在0～4℃溫度條件下研磨，轉入離心管以石英砂調平衡后25 000g離心20min，取上清液2.0mL，用提取液定容至5.0mL。緩慢加入（NH4）2SO4粉末1.5g，振蕩均勻。0℃下沉降2h后，25 000g、4℃下離心20min，棄去上清液，將沉淀溶于3.0mL酶溶解液（0.05mol／L pH＝7.0磷酸鉀緩沖液，內含20mmol／L的丙酮酸鈉，0.5mmol／L MgCl2）中，用于酶活力測定。

酶活力測定：取0.4mL酶提取液，加入0.1mL 0.05mol／L pH＝7 的磷 酸鉀緩沖 液，再加入0.5mL酶反應液（0.05mol／L pH＝7的磷酸鉀緩沖液，內含 24mmol／L 的丙酮酸鈉，0.6mmol／L MgCl2，1mmol／L的 TPP，20μmol／L的FAD），搖勻后放入35℃恒溫水域中暗處反應1h后，立即加入0.1mL 3mol／L的 H2SO4終止反應，并置于60℃恒溫水域中脫羧反應15min，然后依次加入0.5mL 0.5%的肌酸和0.5mL 5%甲萘酚（溶于2.5mol／L的NaOH溶液）。60℃顯色反應15min，冷卻后于525nm處測定A值。

2 結果與討論

2.1 AD－67對玉米的保護效果

AD－67單獨作用于玉米植株時，對玉米根長和株高有輕微的促進作用，但各處理間差異不顯著（表1，表2）。在單嘧磺隆濃度為0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg時，AD－67對由單嘧磺隆產生的對玉米根長和株高的抑制均有緩解作用，且在相同的單嘧磺隆濃度時，不同濃度的安全劑處理間保護效果差異顯著。AD－67濃度在1mg／kg時對各濃度單嘧磺隆產生的藥害解毒效果最好，該處理下，上述3個單嘧磺隆濃度玉米的根長分別為空白對照的107.3%、91.86%、77.71%；株高分別為空白對照的100.82%、100.24%、91.83%。以單嘧磺隆上述各濃度不使用安全劑的處理為對照，該處理下使玉米主根長分別增加了27.81%、28.79%和21.89%；玉米株高分別增加了12.58%、21.69%和18.88%。隨著單嘧磺隆濃度的增加，AD－67保護玉米的效果降低，這與前期安全劑研究的變化規律一致［12］。

表1 AD－67對玉米主根長的保護效果1）

表2 AD－67對玉米株高的保護效果1）

2.2 AD－67對玉米葉中GSH含量的影響

單獨用安全劑AD－67浸種，可提高玉米葉片GSH含量（表3）。當單嘧磺隆濃度為0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg時，AD－67各濃度均能增加玉米葉中GSH的含量；同一單嘧磺隆濃度下，安全劑各濃度處理間的效果差異達到極顯著水平（表3）。當AD－67濃度為1mg／kg時，單嘧磺隆3個處理濃度玉米葉片中GSH含量增加最多，與無AD－67浸種的玉米葉片中GSH含量相比，分別增加了19.46%、23.55%和19.24%。結果表明：安全劑AD－67對玉米葉片中GSH含量的影響與對主根長和株高的保護效果相一致，即AD－67能夠提高玉米葉中GSH含量，有利于催化GSH綴合更多的除草劑，從而快速解除除草劑的毒害作用，達到保護作物的目的［13］。

表3 AD－67對玉米葉中GSH含量的影響1）

2.3 AD－67對玉米根中ALS酶活性的影響

單獨使用AD－67浸種時，能提高玉米根中ALS活性（表4）。單嘧磺隆濃度為0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg時，AD－67各濃度處理，玉米根中ALS的活性均有一定程度提高；在單嘧磺隆同一濃度時，安全劑不同處理間的ALS活性差異達到極顯著水平。其中AD－67濃度為1mg／kg時，玉米根中ALS活性最高，與無AD－67浸種的玉米根中ALS相比，活 性 分 別 增 加 了 26.66%、40.00% 和33.33%。上述結果說明：在活體條件下單嘧磺隆對玉米幼苗ALS有抑制作用，而保護劑AD－67明顯誘導了玉米幼苗中ALS的活性，提高了玉米幼苗中ALS的含量。

表4 AD－67對玉米根中ALS活性的影響1）

3 結論與討論

GSH是生物細胞中普遍存在的一種具有特殊功能的多肽，在生物的許多代謝生理過程中起到重要的生理作用。在高等植物的代謝生理過程中發現，植物在抵御不良環境及提高抗逆作用中，GSH起著非常重要的作用。研究表明：安全劑可以刺激玉米和其他植物中的GSH水平，達到解毒的目的［14－15］。單嘧磺隆通過對ALS酶的抑制而阻斷支鏈氨基酸的生物合成，進而快速抑制植物細胞的分裂與伸長，達到化學除草的目的。范志金等研究表明，單嘧磺隆對不同玉米品種ALS的活性影響存在差異，高濃度則具有抑制作用，活體ALS活力差異與玉米品種的耐藥力無相關性［6］。路凱等研究表明NA能間接激活ALS活性，從而減輕胺苯磺隆對水稻的藥害［16］。安全劑對于ALS抑制劑的解毒作用機理并不是一個簡單的線性化作用過程，也不是由一種物質或一個原因引起的。參與這一過程的各種物質交織在一起，相互作用和牽制，形成一種復雜的網式過程，從而出現解毒差異—表征［17］。

本研究表明：單嘧磺隆對玉米幼苗的生長指標（根長、株高）和生理指標（GSH含量、ALS活性）都有抑制作用；隨著單嘧磺隆濃度的增加，抑制作用加強，且對生理指標的抑制比對生長指標的程度大，即植株生長指標還沒顯示出被害癥狀時其體內某些生理指標已經發生顯著變化。在安全劑AD－67浸種處理下，玉米的生長指標、GSH含量、ALS活性均有不同程度的提高；在同一單嘧磺隆濃度下，安全劑各濃度處理之間的解毒效果差異達到顯著或極顯著的水平，當AD－67濃度為1mg／kg時，對玉米的保護效果最好。試驗顯示：當AD－67與單嘧磺隆濃度為一定配比時，才能較好地起到保護作物免受除草劑藥害的作用。這說明高濃度的安全劑對作物也是一種外源化合物，會刺激和影響作物的生長［18］。AD－67能夠提高玉米體內GSH含量，并增加ALS活性，從而緩解了單嘧磺隆對玉米幼苗產生的藥害，表明了這是減輕單嘧磺隆對玉米藥害的重要途徑之一，即AD－67的解毒和代謝過程與作物體內的GSH和ALS含量密切相關。

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