黃連解毒湯對幼齡自發(fā)性高血壓大鼠內(nèi)皮功能影響研究*

岳桂華，張志偉，孟子譽

(廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院，廣西南寧 530011)

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是臨床常見的心血管疾病之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓階段時存在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[1]，內(nèi)皮功能障礙甚至成為高血壓病人不良結(jié)局的預(yù)測因子，但其與高血壓發(fā)病的因果關(guān)系卻尚未明了。高血壓和內(nèi)皮功能障礙具有相似的病因和發(fā)病機制，目前多數(shù)認(rèn)為高血壓是內(nèi)皮功能障礙的病因，但也有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮功能紊亂可出現(xiàn)在血壓增高以前一段時期前[2]。SHR是國際公認(rèn)的最接近于人類原發(fā)性高血壓的動物模型，研究幼齡SHR可以更好地了解內(nèi)皮功能情況。因此，我們以幼齡SHR為研究對象，并以黃連解毒湯為施加因素，觀察幼齡SHR內(nèi)皮功能變化，探討黃連解毒湯防治高血壓的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

雄性6周自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)16只和同類6周正常血壓wistar-kyoto(WKY)8只，體重80g～130g，SHR購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證號SCXK(京)2006～0009)。WKY組為空白對照，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心(合格證號SCXK(桂)2006-0003)，SHR隨機分為黃連解毒湯組、模型組每組8只。動物正常光照，食水自由攝取，室溫控制在18℃ ～22℃之間。

1.2 方法

1.2.1 藥物干預(yù) 黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按3∶2∶2∶3比例組成，其藥材均購于廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院藥劑科，專人負(fù)責(zé)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，煎煮取汁，濃縮成清膏(1g清膏相當(dāng)于1.5g黃連解毒湯生藥)。蒸餾水稀釋1倍后，HLJD組按10ml/kg/d灌胃，模型組和正常對照組按10ml/kg/d灌服蒸餾水。藥物充分用蒸餾水混勻，于每日上午9時灌胃給藥，SHR對照組及WKY正常對照組每日同時用等容積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)給藥6周。

1.2.2 試劑及儀器 ET-1和vWF試劑盒由武漢中美科技有限公司生產(chǎn);SOD、MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn);BP-6大鼠無創(chuàng)血壓測試儀由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn);MK3酶標(biāo)儀由美國Thermo生產(chǎn);1575洗板機由美國BIO-RAD生產(chǎn)。

1.2.3 血壓測量 分別于給藥前及給藥后1、2、4、6周，測量大鼠安靜清醒狀態(tài)下尾動脈收縮壓(SBP)。每只鼠連續(xù)測量SBP 3次，間隔60s，取其平均值為當(dāng)次所測得血壓值。

1.2.4 樣品采集與測定 大鼠給藥6周后，用2%戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血6ml，按3000r/min 離心10 min，用于 NO、ET-1、vWF、SOD和MDA水平的檢測。標(biāo)本均置于－20℃冰箱保存待測。ET-1、vWF測定采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)。ET-1產(chǎn)品編號為E0482r，vWF產(chǎn)品編號為E0833r，操作步驟均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。硝酸還原法測定血漿NO的含量，黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)檢測SOD，硫代巴比妥酸比色法檢測MDA。其中血漿NO采用硝酸還原酶法，通過顯色深淺測定其濃度的高低;SOD測定通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光分光光度儀測其吸光度。當(dāng)被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對幼齡大鼠血壓的影響

正常情況下6周幼齡大鼠的血壓仍然處于自發(fā)性初始升高的階段。表1顯示，與空白對照組比較，治療前各組SHR大鼠沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，模型對照組隨著鼠齡的增長呈現(xiàn)血壓進(jìn)行性增高，在實驗開始第2周時表現(xiàn)出的血壓升高P<0.05，第6周時的血壓升高P<0.01。而黃連解毒湯組能降低大鼠進(jìn)行性血壓增高的趨勢，治療6周后血壓前后變化沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與同時間段模型組比較，在給藥第4周后對SHR產(chǎn)生了顯著的降壓作用(P<0.05);與空白對照組比較，給藥第4周后，黃連解毒組的血壓水平與空白對照組水平相當(dāng)(P>0.05)。

2.2 對幼齡 SHR 血漿 NO、ET-1、vWF、SOD、MDA的影響

表2顯示，與空白組比較，模型組幼齡SHR血漿中 vWF、MDA 升高(P<0.05或 P<0.01)，NO、SOD降低(P<0.05)，ET-1無明顯變化，表明SHR在高血壓前期已存在內(nèi)皮功能不全。與模型組比較，黃連解毒能夠顯著降低血漿vWF、MDA(P<0.05)，升高 NO、SOD(P<0.05)。

表1 治療前后各組大鼠血壓的變化(s，mmHg，n=8)

表1 治療前后各組大鼠血壓的變化(s，mmHg，n=8)

注:與同時間段空白對照組比較:#P<0.05，##P<0.01;與同時間段模型組比較:＆P<0.05，＆＆P<0.01

組 別 0周 1周 2周 4周 6周空白對照組 119.68±2.04 115.96±2.86 114.81±3.37 114.36±3.00 115.02±2.08模型對照組 121.78±5.51 122.47±8.32 124.66±9.31# 130.02±13.18# 136.64±2.72##黃連解毒組 123.84±8.84 124.04±9.63 125.00±8.79# 116.25±5.06＆ 116.56±3.08＆

表2 治療前后各組大鼠血漿NO、ET-1、vWF、SOD、MDA的變化(s)

表2 治療前后各組大鼠血漿NO、ET-1、vWF、SOD、MDA的變化(s)

注:與空白對照組比較:#P<0.05，##P<0.01;與模型對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

組 別 動物數(shù) NO(μmol/L)ET-1(pg/ml)vWF(ng/ml)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)空白對照組 8 31.141±6.964 73.732±16.262 2740.514±939.512 132.809±14.692 2.990±0.453模型對照組 7 20.795±7.037# 86.979±11.941 6940.451±843.673## 114.652±15.261# 4.170±0.408#黃連解毒組 8 33.807±9.771* 78.307±19.495 5571.707±1322.095##*137.920±16.033* 3.512±0.995*

3 討論

自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)是1963年Okamoto用Wistar大鼠培育而成的，其被毛呈白色，無明顯原發(fā)性腎臟或腎上腺損傷，心血管疾病發(fā)生率高。SHR從發(fā)病機制、高血壓心血管并發(fā)癥、外周血管阻力變化、對鹽的敏感性等多方面來講，都與人類高血壓患者相似，是目前國際公認(rèn)的最接近于人類原發(fā)性高血壓的動物模型，是基礎(chǔ)研究及藥物篩選的首選。該種大鼠出生后3～4周血壓開始升高，12～24周時達(dá)到高峰，因此出生后4～12周是血壓持續(xù)升高的重要階段。

黃連解毒湯首載于葛洪《肘后備急方》，但未給出方名，王燾《外臺秘要》始冠以黃連解毒湯之名。本方由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥按比例配伍組成，其中以黃連瀉心火、兼瀉中焦之火為君;黃芩清肺熱、瀉上焦之火為臣;黃柏瀉下焦之火，梔子通瀉三焦之火，導(dǎo)熱下行，合為佐使，共收瀉火解毒之功。黃連解毒湯及其配伍成分在心血管疾病的防治中起著越來越重要的作用，在臨床上已用于高血壓等心血管疾病的治療。我們觀察表明，6周齡的SHR血壓與WKY有增高的趨勢，但無明顯差異(P>0.05);8周齡模型組增高明顯，12周齡后非常明顯。研究表明，與模型組比較黃連解毒湯組能降低SHR的血壓(P<0.05)，表明該方能在幼齡SHR控制高血壓的上升。

一般認(rèn)為，高血壓病和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙之間有密不可分的關(guān)系，高血壓是內(nèi)皮損傷的始動因素之一[3]。內(nèi)皮損傷程度可以反映高血壓患者病情嚴(yán)重程度，且內(nèi)皮功能障礙有遺傳傾向[4]。原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮功能減退，NO生成減少或生物利用度降低，可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。其機制是高血壓內(nèi)皮損傷后，NOS作用底物L(fēng)2精氨酸缺乏，NOS活性受限、表達(dá)異常或其輔助因子異常，自由基生成增多，超氧化物歧化酶(SOD)缺乏致超氧陰離子生成，NO生成減少和活性被破壞，且生物利用度降低，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性舒血管作用下降。研究表明[5～7]，正常情況下，機體各組織包括血漿均含有一定活性的抗氧化酶系，可及時有效地清除氧自由基。SOD是其中最重要的抗氧化劑，是人體內(nèi)天然的抗氧化酶，通過催化超氧陰離子自由基的自身氧化還原反應(yīng)，有效清除自由基，維持體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡，以避免損傷機體的組織細(xì)胞。應(yīng)用外源性SOD和過氧化氫酶，可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功，松弛血管平滑肌。NO是一種血管內(nèi)皮舒張因子，具有松弛平滑肌、舒張血管的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以合成NO，后者彌散入血管平滑肌細(xì)胞，活化鳥苷酸環(huán)化酶，使GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，后者促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，引起平滑肌松弛，血管擴張和血壓下降。高血壓病患者SOD水平較對照組顯著下降，MDA的增加也印證了SOD的下降，提示高血壓病患者存在氧化反應(yīng)增強及抗氧化能力降低，體內(nèi)活性氧增加，引起并加重內(nèi)皮功能失調(diào)。

對有原發(fā)性高血壓家族史血壓正常子代的研究發(fā)現(xiàn)，其基礎(chǔ)NO分泌減少，除提示內(nèi)皮功能障礙有遺傳傾向外，同時也說明NO分泌減少，內(nèi)皮依賴性的舒張功能受損也是導(dǎo)致高血壓的危險因素[8]。也有研究表明，有高血壓家族史的正常子代體內(nèi)的ET-1水平并不增高，而NO水平卻顯著性增高，并且有NO水平增高的子代易患高血壓，提示可能這些人的機體內(nèi)存在NO抵抗。NO和ET-1的分泌失衡是導(dǎo)致高血壓的重要影響因素。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的很多活性物質(zhì)如凝血酶、ADP、ATP、5羥色胺等舒血管作用變?yōu)榭s血管作用，從而影響ET-1、NO的協(xié)調(diào)狀態(tài)，破壞了自身調(diào)節(jié)體系的平衡，使得ET合成增多，影響NO的合成和釋放，導(dǎo)致血管張力調(diào)節(jié)的紊亂，內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，收縮功能增強，血管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致血壓的升高。而主要是NO生成不足或活性降低，致使內(nèi)皮功能障礙，引起高血壓的發(fā)生。同時研究表明，vWF是內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能不全的標(biāo)記物之一，血漿vWF升高表明存在內(nèi)皮功能障礙。

我們研究表明，模型組SHR血漿中NO、SOD降低，vWF、MDA上升，較空白對照有明顯差異(P<0.05)，ET-1有上升的趨勢，但無統(tǒng)計意義(P>0.05)，表明SHR在血壓達(dá)到高峰前已存在內(nèi)皮功能不全。提前應(yīng)用黃連解毒湯能保護(hù)受損的內(nèi)皮功能，這也體現(xiàn)了中醫(yī)的“治未病”思想和理念。但黃連解毒湯預(yù)防高血壓的確切機制還有待進(jìn)一步的研究。

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